[發明專利]一種家豬印記基因Rasgrf1的鑒定方法

在審

• 申請號: 201510080249.2
• 申請日: 2015-02-12
• 公開（公告）號: CN104673916A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 丁月云;殷宗俊;周杰;張曉東;劉力源;張威;張淑靜;黃龍;張夢琦;付坤
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 王菊珍

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及一種家豬印記基因Rasgrf1的鑒定方法。

背景技術

基因組印記是一種表觀遺傳現象，印記基因具有單等位表達和親本特異性。通過每個染色體的印記可以對其親本來源進行判斷。然而印記標記的機制研究表明，DNA甲基化在基因組印記現象中起重要作用，因此甲基化動態和印記機制成為研究熱點。大部分印記基因成簇存在，絕緣子調控模型或長鏈非編碼RNAs調控模型對其表達進行調控。越來越多的證據表明DNA甲基化不僅僅與印記基因表達相關，同時，印記基因的表達調控還與翻譯后組蛋白修飾有關。

目前，對基因組印記的研究主要集中在人和鼠中，而在家畜，特別是豬上的研究較少。因此在豬上鑒定印記基因對于基因組印記在物種間的保守性研究具有重要意義。此外，家畜大多數印記基因是調控生長發育的主效基因，這些基因對胚胎早期發育、出生后的生長速度、產肉量、瘦肉率、飼料效率等數量性狀有極大影響。基于印記基因在生長和發育中的重要調控作用，鑒定出新的豬印記基因是一個值得探討的新課題。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種效果理想、成本低、操作簡便的家豬印記基因Rasgrf1的鑒定方法。

(1)采用PCR-SSCP-PAGE的方法查找Rasgrf1基因外顯子序列SNP(single?nucleotide?polymorphism,單核苷酸多態性)：

I.提取皖南黑豬和巴克夏豬的DNA，進行Rasgrf1基因外顯子1和外顯子14部分序列的克隆；

II.PCR-SSCP方法分型；

III.不同基因型個體PCR產物的純化、克隆和測序。

(2)總RNA的提取和cDNA的制備：

I.正反雜交模型的建立：正交：巴克夏豬♂×皖南黑豬♀；反交：皖南黑豬♂×巴克夏豬♀；巴克夏豬♂與皖南黑豬♀交配產生的F1代仔豬為正交F1，皖南黑豬♂與巴克夏豬♀交配產生的F1代仔豬為反交F1；

II.SNP位點雜合個體的篩查：出生1日齡的正反交F1代仔豬各8頭，分別提取各親本以及F1代仔豬個體的基因組DNA，用于雜合子鑒定；采用PCR-RFLP方法，基于步驟(1)查找到的SNP位點，該SNP位點處雜合基因型的個體為F1代雜合子仔豬個體；

III.總RNA的提取和cDNA的制備：提取F1代1日齡正反交仔豬各8頭以及雜合子仔豬7頭的14種不同組織的RNA，反轉錄成cDNA；7頭雜合子仔豬中包括正交3頭，反交4頭；14種不同組織為腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、胰臟、背膘、睪丸、子宮、小腸、背最長肌和垂體；

(3)采用RT-PCR-RFLP方法鑒定印記狀態

I.RT-PCR-RFLP鑒定印記狀態：

取F1代1日齡正交3頭、反交4頭雜合子仔豬的14種不同組織cDNA，利用錨定引物進行RT-PCR；采用RT-PCR-RFLP方法檢測雜合子仔豬各組織器官mRNA酶消化帶型，并根據其親本的基因型判斷Rasgrf1基因在特定階段和組織是父系印記還是母系印記或者不存在印記；所述錨定引物的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示；

II.q-RT-PCR

取F1代1日齡正反交仔豬各8頭的14種不同組織cDNA，利用錨定引物進行q-RT-PCR，檢測Rasgrf1基因在14個組織，即腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、胰臟、背膘、睪丸、子宮、小腸、背最長肌和垂體的mRNA表達水平；所述錨定引物對應的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示；

(4)目的基因蛋白水平的檢測

取F1代1日齡正交3頭、反交4頭雜合子仔豬，選取其Rasgrf1基因雙等位基因表達的兩種組織心和脾，單等位基因表達的兩種組織肝和小腸進行Rasgrf1基因編碼的蛋白質分布的研究，包括石蠟組織切片的制作和免疫熒光觀察兩大步驟；

(5)亞硫酸氫鹽修飾后測序的甲基化分析方法

通過對豬Rasgrf1基因啟動子活性的分析，預測核心啟動子區和該片段內CTCF結合區域，經軟件預測確定此兩區域GpG島的分布情況；樣品經過亞硫酸鹽處理后，通過設計特異性引物對其進行PCR擴增，而后測序進行基因甲基化程度分析。

本發明所述的家豬印記基因Rasgrf1的鑒定方法，其中，步驟(4)中石蠟組織切片的制作具體包括如下步驟：