[發明專利]一種家豬印記基因Rasgrf1的鑒定方法

在審

• 申請號: 201510080249.2
• 申請日: 2015-02-12
• 公開（公告）號: CN104673916A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 丁月云;殷宗俊;周杰;張曉東;劉力源;張威;張淑靜;黃龍;張夢琦;付坤
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 王菊珍

1.一種家豬印記基因Rasgrf1的鑒定方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)采用PCR-SSCP-PAGE的方法查找Rasgrf1基因外顯子序列SNP：

I.提取皖南黑豬和巴克夏豬的DNA，進行Rasgrf1基因外顯子1和外顯子14部分序列的克隆；

II.PCR-SSCP方法分型；

III.不同基因型個體PCR產物的純化、克隆和測序。

(2)總RNA的提取和cDNA的制備：

I.正反雜交模型的建立：正交：反交：巴克夏豬與皖南黑豬♀交配產生的F1代仔豬為正交F1，皖南黑豬與巴克夏豬♀交配產生的F1代仔豬為反交F1；

II.SNP位點雜合個體的篩查：出生1日齡的正反交F1代仔豬各8頭，分別提取各親本以及F1代仔豬個體的基因組DNA，用于雜合子鑒定；采用PCR-RFLP方法，基于步驟(1)查找到的SNP位點，該SNP位點處雜合基因型的個體為F1代雜合子仔豬個體；

III.總RNA的提取和cDNA的制備：提取F1代1日齡正反交仔豬各8頭以及雜合子仔豬7頭的14種不同組織的RNA，反轉錄成cDNA；7頭雜合子仔豬中包括正交3頭，反交4頭；14種不同組織為腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、胰臟、背膘、睪丸、子宮、小腸、背最長肌和垂體；

(3)采用RT-PCR-RFLP方法鑒定印記狀態

I.RT-PCR-RFLP鑒定印記狀態：

取F1代1日齡正交3頭、反交4頭雜合子仔豬的14種不同組織cDNA，利用錨定引物進行RT-PCR；采用RT-PCR-RFLP方法檢測雜合子仔豬各組織器官mRNA酶消化帶型，并根據其親本的基因型判斷Rasgrf1基因在特定階段和組織是父系印記還是母系印記或者不存在印記；所述錨定引物的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示；

II.q-RT-PCR

取F1代1日齡正反交仔豬各8頭的14種不同組織cDNA，利用錨定引物進行q-RT-PCR，檢測Rasgrf1基因在14個組織，即腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、胰臟、背膘、睪丸、子宮、小腸、背最長肌和垂體的mRNA表達水平；所述錨定引物對應的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示；

(4)目的基因蛋白水平的檢測

取F1代1日齡正交3頭、反交4頭雜合子仔豬，選取其Rasgrf1基因雙等位基因表達的兩種組織心和脾，單等位基因表達的兩種組織肝和小腸進行Rasgrf1基因編碼的蛋白質分布的研究，包括石蠟組織切片的制作和免疫熒光觀察兩大步驟；

(5)亞硫酸氫鹽修飾后測序的甲基化分析方法

通過對豬Rasgrf1基因啟動子活性的分析，預測核心啟動子區和該片段內CTCF結合區域，經軟件預測確定此兩區域GpG島的分布情況；樣品經過亞硫酸鹽處理后，通過設計特異性引物對其進行PCR擴增，而后測序進行基因甲基化程度分析。