[發(fā)明專利]一種多角體蛋白包裹型植酸酶

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510079969.7
• 申請(qǐng)日: 2015-02-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104560934A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁林;郭建軍;曾靜;靳亮;邱小忠;楊一兵;魏國(guó)汶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江西省科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C12N11/04
• 分類號(hào): C12N11/04;C12N9/16;C12N15/866
• 代理公司: 深圳市明日今典知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44343
• 代理人: 羅志強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多角體蛋白包裹型植酸酶。具體地講，本發(fā)明涉及共表達(dá)植酸酶基因及多角體蛋白基因的重組多角體桿狀病毒的構(gòu)建及多角體包裹型植酸酶。

背景技術(shù)

植酸酶是一種能將飼料中植酸磷水解成無(wú)機(jī)磷和肌醇的新型單胃動(dòng)物飼料添加劑，主要應(yīng)用于豬、雞、鴨等單胃動(dòng)物和水產(chǎn)養(yǎng)殖類動(dòng)物，應(yīng)用范圍廣、需求量大。它可使植物性飼料中磷的利用率提高60％，糞便中磷排泄量減少40％，同時(shí)還可降低植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用。因此在飼料中添加植酸酶對(duì)提高畜禽業(yè)生產(chǎn)效益及降低植酸磷對(duì)環(huán)境的污染有重要意義。它在歐洲使用較為廣泛，但在我國(guó)到目前為止，植酸酶并沒(méi)有在飼料中得到廣泛的推廣應(yīng)用，主要原因在于：1、植酸酶在天然材料中的含量太低，難以大量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本昂貴；2、植酸酶的抗逆性，尤其是熱穩(wěn)定性不能完全滿足飼料及飼料加工的要求。

昆蟲(chóng)病毒多角體(polyhedra)是指昆蟲(chóng)病毒在感染宿主細(xì)胞后產(chǎn)生的多面體粒子，其主要用來(lái)包裹病毒粒子。它的功能是保護(hù)包裹的病毒顆粒免受不良環(huán)境的破壞，比如：高溫、干燥、輻射等，以及它對(duì)各種蛋白分解酶也有抗性，并且在酸性條件下極其穩(wěn)定，而在堿性環(huán)境下易溶解并釋放出病毒粒子。如：Ijiri等人將蛋白激酶C(protein kinase C)包裹進(jìn)入了質(zhì)型多角體中，并發(fā)現(xiàn)包裹型的蛋白激酶C相對(duì)于沒(méi)有經(jīng)過(guò)包裹的蛋白有更強(qiáng)生物學(xué)活性和持續(xù)的藥物緩釋效果；被多角體包裹的表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor)不僅藥效延長(zhǎng)了，而且其能抵抗高強(qiáng)度的射線破壞；曹翠平等人利用多角體包埋外源蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)包埋的EGFP蛋白(綠色熒光蛋白)放置2個(gè)月后仍能檢測(cè)到綠色熒光，而干燥處理30min后同樣能檢測(cè)到蛋白活性。這些研究表明多角體是耐酸、抗輻射、抗干燥并具有包裹異源活性蛋白特性的優(yōu)良載體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種多角體蛋白包裹型植酸酶，經(jīng)多角體包裹后的植酸酶具有耐酸、抗高溫、高效、持續(xù)、緩釋等特點(diǎn)。具體是包括利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，同時(shí)將質(zhì)型多角體蛋白基因和植酸酶基因分別構(gòu)建到pFastBacTMDual載體的PH與p10啟動(dòng)子下，并在植酸酶基因前引入SP引導(dǎo)基因，構(gòu)建含有植酸酶基因及多角體基因的重組桿狀病毒；通過(guò)該重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞(如Sf9或Sf21)，可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量被多角體包裹的植酸酶的顆粒；通過(guò)分離、提取純化感染了重組桿狀病毒的細(xì)胞獲得大量的多角體顆粒；對(duì)純化到的多角體顆粒進(jìn)行植酸酶活性分析，驗(yàn)證多角體包裹型植酸酶具有耐酸、抗高溫、高效、持續(xù)、緩釋等特性。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種多角體蛋白包裹型植酸酶，由植酸酶aPPA分子和包裹層組成，所述包裹層為昆蟲(chóng)質(zhì)型多角體蛋白，所述植酸酶aPPA分子以固態(tài)分子的形式被包裹于所述昆蟲(chóng)質(zhì)型多角體蛋白內(nèi)；所述多角體蛋白包裹型植酸酶的顆粒大小為0.1～1μm，植酸酶蛋白濃度占比為10％～70％。

優(yōu)選地，所述多角體蛋白包裹型植酸酶是通過(guò)如下方法制成，具體步驟如下：

A、利用病毒基因組所展現(xiàn)的密碼子偏倚性，選取植酸酶的密碼子，合成植酸酶aPPA基因，所述植酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

B、將步驟A的所述植酸酶aPPA基因構(gòu)建到pFastBacTMDual載體的p10啟動(dòng)子下，并在所述植酸酶aPPA基因前引入SP引導(dǎo)基因，構(gòu)建含有植酸酶aPPA基因及多角體基因的重組桿狀病毒載體，所述SP引導(dǎo)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述多角體基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

C、將步驟B中的所述重組桿狀病毒載體與桿狀病毒骨架重組，獲得重組桿狀病毒；

D、用步驟C中的所述重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，分離純化多角體顆粒，即得到多角體蛋白包裹型植酸酶。

優(yōu)選地，步驟D中所述昆蟲(chóng)細(xì)胞為Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞或Sf21昆蟲(chóng)細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述多角體蛋白包裹型植酸酶中植酸酶蛋白濃度占比為45％～55％。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下，通過(guò)構(gòu)建含有含編碼植酸酶的嵌合基因重組多角體桿狀病毒載體，并將含編碼植酸酶的基因插入到病毒骨架載體中，獲得能表達(dá)多角體包裹型植酸酶的重組多角體桿狀病毒BmBacmid。與其他方式表達(dá)的植酸酶作為飼料添加劑種種不足(如酶活低、穩(wěn)定性差、易失活等)相比，由重組多角體桿狀病毒BmBacmid表達(dá)產(chǎn)生的多角體蛋白包裹型植酸酶具有耐酸、抗高溫、持久緩釋等效果。

附圖說(shuō)明