[發(fā)明專利]一種用于檢測沙門氏菌的探針、試劑盒和方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510079374.1
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104694638A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方國偉;洪冉;劉振世;易春
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州達麥迪生物醫(yī)學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測用的探針，具體涉及一種用于檢測沙門氏菌的探針、試劑盒和方法。

背景技術(shù)

沙門氏菌是臨床上重要的致病菌，2012年WHO數(shù)據(jù)顯示：全球每年由沙門氏菌感染引起的死亡病例達210萬，其中100萬以上是5歲以下兒童。據(jù)統(tǒng)計，中國53％的沙門氏菌可引起兒童的社區(qū)獲得性肺炎，7％-9％的沙門氏菌感染會引起細菌性腦膜炎。此外，中國是沙門氏菌引起感染病例最多的國家之一，占全球病例的12％，也是5歲以下兒童沙門氏菌感染引起死亡病例數(shù)最多的國家之一。為有效控制沙門氏菌感染的傳播，以及降低疾病造成的危害，建立準確，快速的檢測方法是首要任務(wù)。

目前臨床上檢測沙門氏菌常用的方法有細菌培養(yǎng)法、乳膠凝集法和PCR法。其中細菌培養(yǎng)法是檢測沙門氏菌的金標準，但(1)抗生素的廣泛使用要以使其分離率大大降低；(2)非侵襲性疾病不伴有菌血癥，血液培養(yǎng)難有陽性結(jié)果；(3)因為沙門氏菌常在上呼吸道定植，呼吸道標本的細菌培養(yǎng)結(jié)果會受到干擾。深部呼吸道標本的細菌培養(yǎng)可以確診，去需要侵入性操作，如肺穿刺等，通常令患兒的家長難以接受。此外該方法需要二氧化碳培養(yǎng)箱和脫纖維羊血培養(yǎng)基，并且需要16-18小時才能看到檢測結(jié)果，檢測成本高、檢測周期長。乳膠凝集法原理是利用沙門氏菌莢膜的抗原性，用覆蓋了所有沙門氏菌血清型的抗體來致敏乳膠顆粒。有沙門氏菌存在時，其莢膜上的抗原和乳膠顆粒上的抗體可發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見的乳膠顆粒凝集現(xiàn)象。此法可以快速鑒定沙門氏菌。乳膠凝集法的局限性在于如果檢測的細菌數(shù)量較少，會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，需要傳以獲得足夠量的菌；此外有些C群鏈球菌可能發(fā)生假陽性反應(yīng)。利用PCR方?法可在短時間內(nèi)使特定的核酸序列拷貝數(shù)幾何級數(shù)增加，有很高的靈敏度和特異性，但缺點是假陽性率高，另一方面，患者分泌物中有往往含有抑制PCR反應(yīng)的成分，這又會導致假陰性的出現(xiàn)，這兩方面的缺點限制了PCR檢測的臨床應(yīng)用。目前，已有用熒光原位雜交(FISH)檢測沙門氏菌的報道，但均采用的是線形探針，該方法的缺點是，雜交完成后，必須用嚴格的洗滌條件來除去未雜交的探針，而且經(jīng)常會因為探針清洗不完全而造成假陽性。由此可見，沙門氏菌感染的臨床診斷，急需更簡潔、靈敏的檢測方法。

分子信標探針(Molecular?beacon?probe)，具有靈敏度高、特異性強、只有和靶序列雜交上了才會發(fā)出熒光等優(yōu)點，被應(yīng)用于熒光原位雜交。本發(fā)明通過對大量沙門氏菌和其它細菌菌株的16S?rRNA序列進行比對，挑選沙門氏菌的特異性序列，設(shè)計、合成分子信標探針，建立穩(wěn)定的分子信標原位雜交反應(yīng)體系，克服了沙門氏菌當前臨床檢測的諸多問題，為沙門氏菌感染的診斷、預(yù)防和控制提供新的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種探針，所述探針能用于檢測沙門氏菌，通過熒光原位雜交的手段，本發(fā)明還提供了一種快速、靈敏、特異性地檢測沙門氏菌的試劑盒和方法。

為實現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種用于檢測沙門氏菌的探針，所述探針為分子信標探針，所述分子信標探針的堿基序列為5’-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-3’(SEQ?ID?NO:1)；所述探針由頸、環(huán)兩部分組成，其中環(huán)部分的序列為TATTGGAAACGATAGCTAAT，環(huán)部分的序列固定不變，用于與沙門氏菌16sRNA結(jié)合；莖部分的序列位于探針序列的兩端，是除去環(huán)部分以外的探針序列，莖部分的序列可變，只要兩端莖序列互補即可

優(yōu)選地，所述探針5’端的熒光基團為FITC、FAM和Cy3中的一種，所述探針3’端的熒光淬滅基團為DABCYL、BDH和TANRA中的一種。

優(yōu)選地，所述探針的5’端用FAM標記，3’端用DABCAL標記，熒光基團激發(fā)波長495nm，檢測波長520nm。

本發(fā)明所述探針是通過核酸雜交的原理檢測沙門氏菌的，其樣品的來源包含但不限于食品、水源、土壤、臨床樣本以及這些樣品的培養(yǎng)物等；

本發(fā)明提供了一種基于熒光原位雜交快速檢測沙門氏菌的試劑盒，所述試劑盒包括：

(1)上述所述的探針；

(2)重懸固定液；?

(3)雜交液；

(4)洗滌液；

所述重懸固定液包括：