[發明專利]一種用于檢測沙門氏菌的探針、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201510079374.1
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104694638A
• 公開（公告）日: 2015-06-10
• 發明（設計）人: 方國偉;洪冉;劉振世;易春
• 申請（專利權）人: 蘇州達麥迪生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

1.一種基于熒光原位雜交檢測沙門氏菌的分子信標探針，其特征在于，所述探針為分子信標探針，所述分子信標探針的堿基序列為5’-CTGCATATTGGAAACGATAGCTAATTGCAG-3’；所述探針由頸、環兩部分組成，其中環部分的序列為TATTGGAAACGATAGCTAAT，環部分的序列固定不變，用于與沙門氏菌16sRNA結合；莖部分的序列位于探針序列的兩端，是除去環部分以外的探針序列，莖部分的序列可變，只要兩端莖序列互補即可。

2.根據權利要求1所述的用于檢測沙門氏菌的探針，其特征在于，所述探針5’端的熒光基團為FITC、FAM和Cy3中的一種，所述探針3’端的熒光淬滅基團為DABCYL、BDH和TANRA中的一種。

3.根據權利要求1所述的用于檢測沙門氏菌的探針，其特征在于，所述探針的5’端用FAM標記，3’端用DABCAL標記，熒光基團激發波長495nm，檢測波長520nm。

4.一種基于熒光原位雜交快速檢測沙門氏菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

(1)權利要求1或2中所述的探針；

(2)重懸固定液；

(3)雜交液；

(4)洗滌液；

所述重懸固定液包括：

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述雜交液包括5％(w/v)PEG，50mM?NaCl，40％(v/v)甲酰胺，0.5％(w/v)過硫酸銨，1％(w/v)DEPC，1％(w/v)聚蔗糖，50mM?EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM?pH?8.0的Tris-HCl；

所述洗滌液包括50mM?pH?10.0的Tris-HCl，0.5M?NaCl，0.1％(v/v)NP-40，0.5％(v/v)Triton?X-100。

6.一種采用如權利要求3-4任一所述試劑盒快速檢測沙門氏菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1a)取待檢樣品，加入到重懸固定液中，震蕩混勻；

(2a)取步驟(1a)中混勻后的液體滴在載玻片上，然后烘干；

(3a)將步驟(2a)中獲得的載玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干；

(4a)在浸泡后的載玻片上的待檢位置加入雜交液和探針，置于雜交爐中避光雜交；

(5a)將步驟(4a)中獲得的載玻片浸入預熱的洗滌液中洗滌，然后烘干；

(6a)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用10×物鏡掃視和計數，用40或100×物鏡觀察細菌形態；

或者所述方法包括以下步驟：

(1b)取待檢樣品，加入到重懸固定液中，震蕩混勻；

(2b)過濾得到濾液；

(3b)取步驟(2b)中得到的濾液滴在載玻片上，然后烘干；

(4b)將步驟(3b)中獲得的載玻片浸入甲醇中浸泡，然后烘干；

(5b)在浸泡后的載玻片上的待檢位置加入雜交液和探針，置于雜交爐中避光雜交；

(6b)將步驟(5b)中獲得的載玻片浸入預熱的洗滌液中洗滌，然后烘干；

(7b)滴加封片劑后，用熒光顯微鏡鏡檢，用10×物鏡掃視和計數，用40或100×物鏡觀察細菌形態。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(1a)、(1b)中所述待檢樣品與所述重懸固定液的體積比為1:1～1:5，所述步驟(2a)中所述液體滴加的體積為10μL，所述步驟(3b)中所述濾液滴加的體積為10μL，所述步驟(2a)、(3a)、(5a)、(3b)、(4b)、(6b)中的烘干溫度為52℃，所述步驟(3a)、(4b)中所述浸泡時間為5分鐘，所述步驟(5a)、(6b)中洗滌液的預熱溫度為55℃，所述步驟(5a)、(6b)中所述洗滌時間為5分鐘。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(3a)、(4b)中所述雜交液的加入體積為20μL，所述探針加入后的終濃度為20ng/L。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(3a)、(4b)中雜交溫度為52℃，雜交時間為30分鐘。