[發明專利]異源和同源纖維素酶表達體系

在審

• 申請號: 201510078857.X
• 申請日: 2008-06-05
• 公開（公告）號: CN104726350A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發明（設計）人: B·S·鮑爾;E·A·拉雷納斯
• 申請（專利權）人: 丹尼斯科美國公司
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/56;C12N9/42;C12R1/885
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 凌立;黃革生

本申請是發明人于2008年6月5日提交的題為“異源和同源纖維素酶表達體系”的中國專利申請200880101989.8號的分案申請。

與相關申請的交叉參考

本發明要求2007年6月8日提交的美國臨時申請系列號No.US60/933,894的權益和優先權，所述臨時申請完整引入本文作為參考。

關于聯邦政府贊助研究的聲明

通過與美國能源部(United?States?Department?of?Energy)的主合同No.DE-AC36-99G010337下與國家可再生能源實驗室(National?Renewable?Energy?Laboratory)的分合同No.ZC0-0-30017-01，為本工作的部分提供資金。因此，美國政府可對本發明具有某些權利。

引言

纖維素和半纖維素是光合作用產生的最大量的植物材料。它們可以被大量微生物降解并用作能量來源，所述微生物包括細菌、酵母和真菌，它們產生能夠將多聚體底物水解為單體糖的胞外酶。

纖維素酶是水解纖維素(β-1,4-葡聚糖或βD-糖苷鍵)導致形成葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖等的酶。纖維素酶傳統上被分為三個主要的類別：內切葡聚糖酶(EC?3.2.1.4)(“EG”)，外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡糖苷酶([β]-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶；EC3.2.1.21)(“BG”)。內切葡聚糖酶主要作用于纖維素纖維的無定形部分，而纖維二糖水解酶也能夠降解結晶纖維素。為了有效地將微晶纖維素轉化為葡萄糖，需要包含來自CBH、EG和BG分類中每一類的組分的完整纖維素酶體系，分離的組件在水解結晶纖維素中效率較低(Filho等,Can.J.Microbiol.42:1-5,1996)。為了工業規模的纖維素酶生產，在絲狀真菌中表達這些多組件纖維素酶體系纖維素酶會是有利的。

概述

因此，本發明提供了表達異源和同源多肽的組合的絲狀真菌，包含異源和同源多肽的組合的多肽混合物，和產生多肽混合物的方法。

在一些實施方案中，本發明提供了絲狀真菌，其包含一種或多種編碼兩種或更多異源多肽的多核苷酸，和編碼同源多肽的多核苷酸。該絲狀真菌能夠表達異源和同源多肽，所述異源和同源多肽一起形成功能性混合物。

在一些實施方案中，本發明提供了包含本發明的絲狀真菌群體的培養基。

在一些實施方案中，本發明提供了多肽混合物，其包含兩種或更多的異源多肽和同源多肽。該多肽混合物可得自本發明的絲狀真菌。

在一些實施方案中，本發明提供了生產纖維素酶混合物的方法。該方法包括從本發明的絲狀真菌中獲得包含兩種或更多異源多肽和同源多肽的的多肽混合物。在一些實施方案中，異源多肽是外切纖維二糖水解酶和內切葡聚糖酶，同源多肽是外切纖維二糖水解酶。異源外切纖維二糖水解酶和同源外切纖維二糖水解酶可以，但不必須是相同的外切纖維二糖水解酶成員。

本發明的這些特性和其他特性在下文中公開。

附圖概述

熟練的技術人員會理解，附圖僅用于闡述的目的。附圖不旨在以任何方式限制本發明的范圍。

圖1提供了包含2656個堿基的異源纖維素酶融合構建體的核苷酸序列(SEQ?ID?NO:1)。

圖2提供了以圖1的核酸序列為基礎預測的纖維素酶融合蛋白的氨基酸序列(SEQ?ID?NO:2)。

圖3A-F展示了含有E1催化結構域的pTrex4載體的核苷酸序列(SEQ?ID?NO:14)。

圖4展示了里氏木霉(T.reesei)表達載體pTrex3g的質粒圖譜。

圖5A展示了用于制造示范性三部分菌株(tripartite?strain)的表達載體pTrex3g-Hgrisea-cbh1。

圖5B-E提供了圖5A的表達載體的核苷酸序列(SEQ?ID?NO:7)。

圖6展示了被轉化進cbh1缺失菌株中用于創建4-部分菌株的三條DNA片段。