[發明專利]折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201510078743.5
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104911254B
• 公開（公告）日: 2017-11-14
• 發明（設計）人: 黃天誼;黃雨婷;張念恒;佘丹婭
• 申請（專利權）人: 貴州省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/90
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 谷慶紅

技術領域

本發明涉及一種折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒及其檢測方法，屬于醫學檢驗領域。

背景技術

感染人體的瘧原蟲有惡性瘧原蟲(PF)、間日瘧原蟲(PV)、三日瘧原蟲(PM)和卵形瘧原蟲(PO)4種，依次引起惡性瘧、間日瘧、三日瘧和卵型瘧。瘧疾與愛滋病、結核病被列為全球三大公共衛生問題。我國曾流行前2種瘧疾，自2010年起全國瘧疾發病率已連續3年降至1/10萬以下，我國進入消除瘧疾行動階段，但隨著各種國際往來日益頻繁，來自世界高瘧區的4種瘧原蟲(包括不同蟲株，混合感染和低密度帶蟲)，不斷進入我國，2012年境外輸入占全國瘧疾報告病例的91.5％，惡性瘧成為瘧疾發病的主流，過去罕見的卵形瘧和三日瘧頻頻出現，對全面消除瘧疾構成嚴重威脅。我國瘧疾診斷面臨需要快速、準確地檢出至少4種瘧原蟲和極低原蟲血癥的新挑戰。因此，及時發現瘧疾患者，并能準確診斷和分型，是當前瘧疾防治的關鍵，也是制定防治措施以及研制抗瘧藥和疫苗的迫切需要。

現有的診斷方法中，我國常規使用的厚血膜顯微鏡檢查(鏡檢法)和快速診斷試驗(RDT)都達不到檢出低原蟲血癥、混合感染和準確鑒定蟲種的要求。更敏感的基于PCR的分子診斷試驗已有許多報告，如以18S核糖體RNA基因(rRNA)為靶基因的巢式PCR已廣泛應用于研究和臨床診斷，目前已被我國用作瘧疾參比實驗室確診手段。但巢式PCR檢測每份樣本需用5管試劑做2輪PCR反應，費時、費力、且費用高，容易污染和失誤，要求有設備精良的實驗室和由分子診斷專業技術人員操作，另外，經證實，該法不能檢出卵形瘧原蟲變異型，這些問題嚴重限制了巢式PCR的實際應用，不可能用作普通實驗室常規診斷手段，也不適用于大規模篩查和監測。

消除瘧疾的行動階段為全面發現和管理瘧疾病例(包括無癥狀帯蟲者)以阻斷可能的傳播，需要檢出極低原蟲血癥(低至1個蟲/ul血)的診斷工具。雖有很多PCR診斷試驗檢出瘧原蟲的敏感性超過鏡檢法和RDT的檢出極限(50-100個蟲/μl血)，但目前敏感性、特異性最好的仍是作為分子診斷金標準的18S巢式PCR。現有報告巢式PCR檢出濾紙血樣中PF低限為6個蟲和3個蟲/μl血，如使用樣品濃縮方法可檢出0.5個蟲/μl血或更低。近年報告的巢式PCR檢出單一感染的4種瘧原蟲均達到0.4個蟲/μl，也有低至0.086、0.04個蟲/μl,但其測定方法都采用高密度含蟲血提純DNA進行系列稀釋，不能代表現場采集的濾紙血樣的實際檢測結果。

混合感染是瘧疾診斷的另一個難題。混合感染中各種原蟲的密度可能相差懸殊，當混合感染中各種原蟲高、低密度之差在10倍及以上時，傳統PCR優先擴增高密度模板致迅速形成壟斷，低密度蟲種的擴增則受抑制甚至被完全掩蓋形成假陰性。2010年Tonya M-H等用混合的實驗室提取的DNA評估三種PCR(巢式，半巢式多重，和單管多重)檢出模擬混合感染效率的結論是：半巢式和單管多重PCR只能檢出和鑒定其中2種原蟲DNA，巢式PCR是唯一能夠檢出和正確識別實驗混合4種瘧原蟲DNA的最好方法。到目前為止還沒有其他分子診斷試驗達到或超過巢式PCR檢出4種瘧原蟲混合感染水平的報告。

本發明人員在對巢式PCR的前期研究中，建立了標簽引物-套式/多重PCR檢測體系，可同時檢出PF及PV，檢測敏感性為PF1-2個蟲/ul血，PV5-10個蟲/ul血；但檢測健康者血樣易出現非特異擴增，檢測效果不夠穩定。其后，進行了新型引物的設計并試用于克服標簽引物易引發其他非特異擴增的負面影響，取得明顯效果，但該體系仍需兩步擴增，而中途開蓋加樣，會增加操作污染，造成假陽性，且只能檢測PV和PF。其后，在2012年研制出了快速PCR瘧疾分子診斷試劑盒(專利號：201210061134.5)，使試劑復雜操作繁重的傳統套式/多重PCR簡化為單一試劑、單管一步反應，可同時檢出和鑒定惡性瘧(PF)與間日瘧(PV)兩種原蟲的單獨或混合感染，和判定三日瘧(PM)或卵形瘧(PO)的單獨感染，但不能區分三日瘧與卵形瘧原蟲。目前尚未見有單管一步擴增可同時檢出和鑒定4種人瘧原蟲及其混合感染的瘧疾分子診斷技術的報告。

發明內容

本發明的目的：為克服現有巢式PCR同時檢測4種瘧原蟲的診斷實驗需多管兩步擴增，試驗時間長且試劑、操作復雜，需中間開管二次加樣，容易污染和失誤；而單管一步反應的快速PCR只能檢出和鑒定PF與PV兩種瘧原蟲的缺陷；提供一種單管一步擴增能同時檢出和鑒定4種瘧原蟲的單一和混合感染、既靈敏、準確又簡便、快捷的折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒。

本發明的技術方案如下：