[發明專利]折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201510078743.5
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104911254B
• 公開（公告）日: 2017-11-14
• 發明（設計）人: 黃天誼;黃雨婷;張念恒;佘丹婭
• 申請（專利權）人: 貴州省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/90
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 谷慶紅

1.一種折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒，所述診斷試劑盒由模板緩沖液和PCR單一組合試劑組成；其中所述的模板緩沖液為1×含鎂模板緩沖液1.0ml×2支，或1×含鎂模板緩沖液1.0ml×1支和0.1×模板緩沖液預裝0.5ml管×20支，所述預裝管每管400μl；其中所述的單一組合試劑為折疊引物PCR無鎂單一組合試劑200μl×1支或預裝PCR管折疊引物PCR無鎂單一組合試劑每管10μl×20支；其特征在于：

所述的1×含鎂模板緩沖液包含以下組分：30mmol Tris-HCl；30mmol KCl；15mmol(NH₄)₂SO₄；6.6mmol MgCl₂；

所述的無鎂單一組合試劑包含以下組分：具有不同退火與折疊溫度的折疊引物6條；Tris-HCl 30mmol/L；KCl 30mmol/L；NH₄SO₄ 15mmol/L；TMAC 0.001mmol/L；4種核苷酸-4dNTP各200μmol/L；DNA聚合酶-Taq酶0.5U；石蠟油15μl；

所述的具有不同退火與折疊溫度的折疊引物，包括瘧原蟲屬特異公共引物一對，編號Uf-1865、Ur-2855；惡性瘧原蟲(PF)種特異正向引物1條，編號Ff-2545；間日瘧原蟲(PV)、三日瘧原蟲(PM)、卵形瘧原蟲(PO)種特異反向引物各1條，編號Vr-2343、Mr-2520、Or-2748；

所述引物的設計是在每條引物的5’端添加與3’端互補的核苷酸序列，所述3’端即第2～4堿基起至第8～18堿基，具體序列如下：

Uf-1865 5'GTCAAATGGCGTGGAAACACACTTCCCTTCTCGCCATTTGATAG 3'

Ur-2855 5'CTAAGAAGGTTCGATAACCTGTTATCCCCGGCGAACCTTCTTAC 3'

Ff-2545 5'GCTTCTGGATATTATGATAGATAACATACCAGAAG 3'

Vr-2343 5'CGGTGATGCTACTTACTTGGAGAATGTTTTGCATCACCT 3'

Mr-2520 5'GGTATAAAGGATTTTAGTTTATCTCCATGTCCTTTATACG 3'

Or-2748 5'CGGAAGGATGTAAAAGCACATTTAATATCTTATCCTTCCA 3'

所述的折疊引物中，每條屬、種特異引物最佳初始退火溫度間至少相差2～3℃；各條引物3’5’端互補退火的折疊溫度比引物與模板靶序列的初始退火溫度低1～2℃，各擴增片段之間的大小相差150bp以上。

2.如權利要求1所述的折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒，其特征在于，所述的折疊引物中，屬和種特異引物Uf-1865、Or-2748、Mr-2520、Vr-2343的濃度均為87nmol/μL；Ur-2855和Ff-2545的濃度均為70nmol/μL。

3.權利要求1或2所述的折疊引物多重PCR瘧疾分子診斷試劑盒在制備同時檢測和鑒定臨床、流行病學樣本中存在的4種瘧原蟲單獨或混合感染產品中的用途，所述4種瘧原蟲為惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲，其中卵形瘧原蟲包括經典型和變異型。