[發(fā)明專利]一種臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510077547.6
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104630144B
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于艷秋;榮耀星;時兆田;呂亞楠;鄧雯雯;李秀文;張停停
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)科大學(xué);沈陽澔源生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標(biāo)代理有限公司21107
• 代理人: 史力伏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

干細(xì)胞是具有一定自我更新能力，并在適宜微環(huán)境下具有多向分化潛能的原始細(xì)胞，可分化為脂肪、軟骨、骨、肌肉、肌腱、神經(jīng)、肝、心肌等多種組織細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSC）來源于中胚層的非終末分化細(xì)胞，它既有間質(zhì)細(xì)胞，又有內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞的特征，是細(xì)胞治療和組織工程種子細(xì)胞的重要來源。間充質(zhì)干細(xì)胞除來源于骨髓、外周血、脂肪、臍帶外，人臍血也是間充質(zhì)干細(xì)胞的重要來源。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞除上述的分化能力外，甚至具有一定的跨系和跨胚層分化的能力，此外還可支持和促進(jìn)造血細(xì)胞生長，對造血系統(tǒng)重建有非常重要的作用。

臍血是臍帶及胎盤近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，含有豐富的干細(xì)胞和祖細(xì)胞，其主要包含造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。臍血來源充足，采集方便，免疫原性較弱，能更大程度上耐受HLA配型不符，其間充質(zhì)干細(xì)胞更為原始，擴增能力較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更強，故臍血干細(xì)胞的作用越來越突出，可用于各系統(tǒng)疾病的細(xì)胞移植治療和作為基因治療的載體。臍血來源的造血干細(xì)胞已經(jīng)用于治療血液系統(tǒng)疾病，如白血病患者造血系統(tǒng)重建，但是臍血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用價值始終沒有被挖掘。在目前的臍血庫中，存儲的自體臍血使用幾率較小，而公共臍血庫中單份臍血造血干細(xì)胞的數(shù)量往往不能滿足治療需求，由于以上兩方面的原因，95%以上儲存的臍血未得到使用，因此臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的市場開發(fā)價值潛力巨大。

臍血間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)在妊娠前三個月的的胎兒血液循環(huán)中，12周以后間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量開始下降，逐漸在胎兒血液中幾近消失。據(jù)統(tǒng)計出生后臍血間充質(zhì)干細(xì)胞在單個核細(xì)胞中的比例僅0.001-0.01%。有文獻(xiàn)報道從118例臍血中僅成功分離到11例，成功率僅10%左右，成功率高的也僅能達(dá)到20%-35%左右。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法主要是通過貼壁方法，但是臍血中不成熟的間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁能力較弱，按照貼壁法會損失部分細(xì)胞。而采用密度梯度離心法、流式細(xì)胞分選法則由于臍血總量的個體間差異和特異性標(biāo)志物缺乏的原因，提取出來的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞極少，細(xì)胞生長狀態(tài)不好。專利(CN1878860B)采用密度梯度離心法結(jié)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的方法提高臍血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，但是胎牛血清的引入易造成異種蛋白致敏，另外細(xì)胞因子易造成臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，這就限制了其臨床應(yīng)用的范圍。

間充質(zhì)干細(xì)胞盡管有巨大的治療潛能，但是到目前為止尚沒有公認(rèn)的細(xì)胞表面標(biāo)志物，國際細(xì)胞治療協(xié)會通過CD29，CD44，CD73，CD90和CD105等細(xì)胞表面標(biāo)志物來協(xié)助鑒定未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，其標(biāo)準(zhǔn)主要由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)展而來。CD90，又稱Thy-1，是細(xì)胞黏附分子免疫球蛋白超家族的成員，已確定在非淋巴組織的多種干細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、腦細(xì)胞及活化的內(nèi)皮細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)。CD90蛋白在細(xì)胞黏附、外滲和轉(zhuǎn)移中起作用。

細(xì)胞外基質(zhì)蛋白是由動物細(xì)胞合成并分泌到胞外，分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子蛋白或蛋白聚糖。這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動。細(xì)胞外基質(zhì)是動物組織的一部分， 不屬于任何細(xì)胞，一方面為細(xì)胞和組織提供支持、聯(lián)結(jié)、固定、保水、緩沖等物理性的保護(hù)作用，另一方面又是細(xì)胞與外環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換、信息傳遞和匯集的中介。它可通過各種信號傳遞系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、遷移、分化、粘附、代謝、損傷修復(fù)、組織重構(gòu)等各種生理功能，被稱為是人體細(xì)胞和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)者。細(xì)胞外基質(zhì)的成分十分復(fù)雜，除了各型膠原以外，還有各種粘連蛋白、纖連蛋白、氨基聚糖、蛋白聚糖等幾十個類別。

纖連蛋白，也稱纖維連接蛋白，是一種高分子糖蛋白，具有多種生物學(xué)功能，廣泛存在于動物組織中，屬于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的一種。其主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞粘著。純化的纖連蛋白可增強細(xì)胞之間及細(xì)胞與基質(zhì)間的連接，如細(xì)胞表面受體、膠原、纖維蛋白和硫酸蛋白。另外纖連蛋白可以通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的形狀，促進(jìn)細(xì)胞鋪展。在胚胎發(fā)育過程中，纖連蛋白對于許多類型細(xì)胞的遷移和分化是必需的；在細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用纖連蛋白可促進(jìn)細(xì)胞生長，提高貼壁率，增強細(xì)胞代謝水平，縮短細(xì)胞培養(yǎng)時間。專利(CN102876630A)使用層連蛋白和明膠蛋白結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞貼壁，并使用細(xì)胞因子進(jìn)行誘導(dǎo)可成功培養(yǎng)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，但是細(xì)胞的貼壁屬非特異性，細(xì)胞純度受影響。而細(xì)胞因子的使用也存在誘導(dǎo)分化的問題。專利(CN102449141A)使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白用于臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁，存在促貼壁蛋白成分復(fù)雜，細(xì)胞非特異貼壁的問題。