[發明專利]一種臍血間充質干細胞的分離及培養方法

有效

• 申請號: 201510077547.6
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN104630144B
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發明（設計）人: 于艷秋;榮耀星;時兆田;呂亞楠;鄧雯雯;李秀文;張停停
• 申請（專利權）人: 中國醫科大學;沈陽澔源生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標代理有限公司21107
• 代理人: 史力伏

1.一種臍血間充質干細胞的分離及培養方法，包括以下步驟：

步驟1、臍血的采集及運輸；

步驟2、使用分離液對臍血中的單個核細胞進行提取和收集，并對剩余紅細胞組分中的單個核細胞再次分離和提取；

步驟3、洗滌兩次收集的單個核細胞；

步驟4、將非特異性促貼壁蛋白及特異性促貼壁蛋白包被在培養瓶底部；

步驟5、使用無血清培養體系混懸洗滌后的單個核細胞，接種到已包被的培養瓶中，在低氧條件下培養；

步驟6、待原代細胞融合率達到60%時進行傳代培養；

步驟7、使用低氧條件繼續對傳代的臍血間充質干細胞進行培養，待細胞融合率達到80%后進行傳代；

步驟8、對第三代臍血間充質干細胞進行流式細胞鑒定及細胞誘導分化實驗；

步驟9、收集臍血間充質干細胞進行凍存；

所述非特異性促貼壁蛋白為纖連蛋白，濃度為5μg/mL；

所述特異性促貼壁蛋白為CD90單克隆抗體，濃度為100μg/mL；

所述低氧條件為氧氣10%、二氧化碳5%、氮氣85%。

2.如權利要求1所述的臍血間充質干細胞的分離及培養方法，其特征在于，所述臍血采集時間與制備時間的間隔小于8h，臍血體積大于80mL。

3.如權利要求1所述的臍血間充質干細胞的分離及培養方法，其特征在于，所述原代細胞接種后的首次換液時間為4-5天。

4.如權利要求1所述的臍血間充質干細胞的分離及培養方法，其特征在于，所述無血清培養體系為無血清培養液，并添加5%的無血清添加劑。