[發明專利]一個體系同時監測豬場環境中6種病毒污染的多重RT-PCR方法和應用

在審

• 申請號: 201510076421.7
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN105002297A
• 公開（公告）日: 2015-10-28
• 發明（設計）人: 劉興友;魏小兵;張秀林;歐長波;劉明成;王秋霞;賀會利;劉長忠;王麗榮
• 申請（專利權）人: 河南科技學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 新鄉市平原專利有限責任公司 41107
• 代理人: 呂振安

技術領域

????本發明涉及一種豬場環境中主要病毒污染監測的多重RT-PCR技術，屬于生物工程技術領域。

背景技術

養豬業逐漸向集約化、規模化發展，密集型飼養方式是當前主要的養殖模式，豬傳染病主要以環境中的空氣、飼料、飲水、器具、糞便等作為媒介進行傳播。豬瘟病毒(CSFV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2型(PCV-2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)和豬細小病毒(PPV)等是污染規模化豬場的主要病毒。現有的技術主要用于豬發病后的診斷，而缺乏對環境中病毒污染的監測技術，更不能建立預警機制，不能提前防控病毒感染，也不能監測豬場病原的凈化情況。因此，建立豬場環境中上述6種病毒污染多重RT-PCR監測方法，監測豬舍和豬場環境中空氣、飼料、飲水、器具、糞便和豬群的上述6種病毒污染，為建立豬場環境中主要病毒污染預警機制及主要病毒病防控和凈化體系提供了技術支持。

發明內容：

本發明的目的是提供一種測試效果好，使用方便的一個體系同時監測豬場環境中6種病毒污染的多重RT-PCR方法和應用。

本發明的技術方案是，1、一個體系同時監測豬場環境中6種病毒污染的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）引物設計?利用軟件在豬瘟病毒(CSFV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環病毒2型(PCV-2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)和豬細小病毒(PPV)保守區進行引物設計。

?????CSFVF??GCTCCCTGGGTGTTCTAAGT

CSFVR??TGCTGTCCTTCTCATGCTCTT

?????PRRSVF??GGCCAGCCAGTCAATCAG

PRRSVR??GGCAAACTAAACTCCACAGTG

?????JEVF??CAAACTGGCTCTGAAAGG

JEVR??TGTCTCAGGTCCATCTACG

?????PCV-2F??CAGCACCCTGTAACGTTTG

PCV-2R??AGGAGTACCATTCCAACGG

?????PPVF??ACATCTAAATATGCCAGAACACG

?????PPVR??GTTTGCCATGAGTGAGTTAATTT

?????PRVF??CTCCTTGAGCGTCTTCGTCG

??????PRVR???CCTTCCTGTCCAACCCCTTC

把對應片段連接到載體并轉化到大腸桿菌中，獲得大量擴增后，按照1：5的比例將保護劑和DNA混合均勻，制成專用marker，作為參照標準。

2）多重RT-PCR的建立?建立了一個體系同時檢測上述6種病毒的多重RT-PCR方法。

3）空氣樣品采集?通過液體撞擊法采集豬舍內和豬場環境中空氣；用截留分子量為10kD的超濾管超濾離心對病毒進行分離濃縮。

該監測方法所涉及6種病毒（CSFV、JEV、PRRSV、PCV-2、PRV和PPV）的目的片段分別為829bp、1045?bp、275?bp、382?bp、142?bp和636bp。

該多重RT-PCR采用50μL反應體系：2×TaqMaster?Mix為25μL，6種病毒混合引物(20μM/L)共3μL，?6種病毒混合核酸共3μL，滅菌蒸餾水19μL。反應條件為：?94?℃?5min；94?℃?45s；56?℃1m30s；?72?℃?50s循環數為40次，最后72?℃延伸10min，4?℃保存。

豬舍和豬場環境中空氣樣品采集的位置和點數為：豬舍內采集樣品的位置為豬舍過道中央距離地面高度0.5-1m處根據豬舍的面積確定采樣點數，?30m²左右1個采樣點，豬場內采集樣品的位置為豬場中央及院墻周圍四個角落共5個采樣點，距離地面0.5-1m，每個采樣點采集時間為40min，豬場外采集樣品的位置為豬場上、下風口距離200m處各3個采樣點。糞便采集選用早晨喂食后采集新鮮的糞便樣品20g左右。

該方法可用于監測豬舍和豬場環境中空氣、飼料、飲水、器具、糞便和豬群的上述6種病毒污染，為建立豬場環境中主要病毒污染預警機制及主要病毒病防控和凈化體系提供了技術支持。

本發明的發明思路是：

1.?根據Genbank的序列，通過DNAstar比對分析其保守序列，針對其保守序列設計引物。