[發(fā)明專利]一個(gè)體系同時(shí)監(jiān)測豬場環(huán)境中6種病毒污染的多重RT-PCR方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510076421.7
• 申請日: 2015-02-13
• 公開（公告）號: CN105002297A
• 公開（公告）日: 2015-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉興友;魏小兵;張秀林;歐長波;劉明成;王秋霞;賀會利;劉長忠;王麗榮
• 申請（專利權(quán)）人: 河南科技學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 新鄉(xiāng)市平原專利有限責(zé)任公司 41107
• 代理人: 呂振安

1.一個(gè)體系同時(shí)監(jiān)測豬場環(huán)境中6種病毒污染的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）引物設(shè)計(jì)?利用軟件在豬瘟病毒(CSFV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)和豬細(xì)小病毒(PPV)保守區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；

????CSFVF??GCTCCCTGGGTGTTCTAAGT

CSFVR??TGCTGTCCTTCTCATGCTCTT

????PRRSVF??GGCCAGCCAGTCAATCAG

PRRSVR??GGCAAACTAAACTCCACAGTG

????JEVF??CAAACTGGCTCTGAAAGG

JEVR??TGTCTCAGGTCCATCTACG

????PCV-2F??CAGCACCCTGTAACGTTTG

PCV-2R??AGGAGTACCATTCCAACGG

????PPVF??ACATCTAAATATGCCAGAACACG

????PPVR??GTTTGCCATGAGTGAGTTAATTT

????PRVF??CTCCTTGAGCGTCTTCGTCG

????PRVR???CCTTCCTGTCCAACCCCTTC

把對應(yīng)片段連接到載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，獲得大量擴(kuò)增后，按照1：5的比例將保護(hù)劑和DNA混合均勻，制成專用marker，作為參照標(biāo)準(zhǔn)；

2）多重RT-PCR的建立?建立了一個(gè)體系同時(shí)檢測上述6種病毒的多重RT-PCR方法；

3）空氣樣品采集?通過液體撞擊法采集豬舍內(nèi)和豬場環(huán)境中空氣；用截留分子量為10kD的超濾管超濾離心對病毒進(jìn)行分離濃縮。

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一個(gè)體系同時(shí)監(jiān)測豬場環(huán)境中6種病毒污染的方法，其特征在于：該監(jiān)測方法所涉及6種病毒（CSFV、JEV、PRRSV、PCV-2、PRV和PPV）的目的片段分別為829bp、1045?bp、275?bp、382?bp、142?bp和636bp。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一個(gè)體系同時(shí)監(jiān)測豬場環(huán)境中6種病毒污染的方法，其特征在于：該多重RT-PCR采用50μL反應(yīng)體系：2×TaqMaster?Mix為25μL，6種病毒混合引物(20μM/L)共3μL，?6種病毒混合核酸共3μL，滅菌蒸餾水19μL，反應(yīng)條件為：?94?℃?5min；94?℃?45s；56?℃1m30s；?72?℃?50s循環(huán)數(shù)為40次，最后72?℃延伸10min，4?℃保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一個(gè)體系同時(shí)監(jiān)測豬場環(huán)境中6種病毒污染的方法，其特征在于：豬舍和豬場環(huán)境中空氣樣品采集的位置和點(diǎn)數(shù)為：豬舍內(nèi)采集樣品的位置為豬舍過道中央距離地面高度0.5-1m處根據(jù)豬舍的面積確定采樣點(diǎn)數(shù)，?30m²左右1個(gè)采樣點(diǎn)，豬場內(nèi)采集樣品的位置為豬場中央及院墻周圍四個(gè)角落共5個(gè)采樣點(diǎn)，距離地面0.5-1m，每個(gè)采樣點(diǎn)采集時(shí)間為40min，豬場外采集樣品的位置為豬場上、下風(fēng)口距離200m處各3個(gè)采樣點(diǎn)，糞便采集選用早晨喂食后采集新鮮的糞便樣品20g左右。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一個(gè)體系同時(shí)監(jiān)測豬場環(huán)境中6種病毒污染的方法，其特征在于：該方法可用于監(jiān)測豬舍和豬場環(huán)境中空氣、飼料、飲水、器具、糞便和豬群的上述6種病毒污染，為建立豬場環(huán)境中主要病毒污染預(yù)警機(jī)制及主要病毒病防控和凈化體系提供了技術(shù)支持。