[發(fā)明專(zhuān)利]一種從母體血漿中分離富集游離胎兒DNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510075702.0
• 申請(qǐng)日: 2015-02-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104862301B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭良宏
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣州康睿生物醫(yī)藥科技股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)51222
• 代理人: 李高峽,張娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種從母體血漿中分離富集游離胎兒DNA的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

在我國(guó)，每年新生兒出生缺陷多達(dá)80萬(wàn)至120萬(wàn)，盡早進(jìn)行產(chǎn)檢篩查和針對(duì)是最有效的應(yīng)對(duì)措施，然而目前常規(guī)的針對(duì)方法皆為有創(chuàng)興方法，對(duì)胎兒和孕婦都有一定的危險(xiǎn)性，因此發(fā)展新的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷具有重要的臨床意義。1997年Lo等發(fā)現(xiàn)在孕婦血漿中存在少量的游離胎兒DNA(cffDNA)，使得開(kāi)發(fā)母體血漿用于安全無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷(NIPD)成為可能。

然而孕婦外周血中cffDNA含量極少，僅為血漿總游離DNA的19％左右，并且與大量的母體血漿游離DNA混雜在一起，給cffDNA的檢測(cè)和分離造成了極大的困難，如何從孕婦外周血中高效富集cffDNA已經(jīng)成為研究的焦點(diǎn)。

目前，從母體血漿中分離游離胎兒DNA的方法有電泳分離法和磁珠分離法，但是由于游離的無(wú)細(xì)胞胎兒DNA含量極低，實(shí)際上很難用電泳分離法等分離不同大小的DNA片段，電泳法還會(huì)損失樣本，造成污染，而磁珠分離法則較昂貴，回收率也不高。

需要尋找一種有效、簡(jiǎn)便、成本低廉的游離胎兒DNA分離方法。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種從含DNA的樣品中富集分離游離胎兒DNA的方法。

本發(fā)明從含DNA的樣品中富集游離胎兒DNA的方法，包括如下步驟：

(1)離心樣品，取上清；

(2)每1ml上清中加入結(jié)合緩沖液A0.8～1ml、細(xì)胞裂解液50～150μl，混勻，在25℃～65℃條件下放置20～60min；

(3)將步驟(2)處理后的樣品加入到二氧化硅結(jié)合柱上，離心，先用洗滌緩沖液B洗脫；

(4)再用選擇性洗滌緩沖液C洗脫，收集洗脫液；

(5)每1ml洗脫液中加入結(jié)合緩沖液A0.8～1ml，混勻，在25℃～65℃條件下放置20～60min；

(6)重復(fù)步驟(3)；

(7)用洗滌緩沖液D洗脫，再用洗脫緩沖液E洗脫，收集洗脫液，即可。

其中，結(jié)合緩沖液A包含如下成分：

洗滌緩沖液B包含如下成分：

硫氰酸胍 100～140g

0.1MTris鹽酸 80～120ml；

選擇性洗滌緩沖液C由緩沖液B與5M NaCl溶液以1:(2～4)v/v的比例混合而成；

洗滌緩沖液D為含(5～15)mMNaCl的(50％～90％)的乙醇溶液；

(50％～90％)的乙醇溶液：是指乙醇溶液的濃度為50％～90％(v/v)。

洗脫緩沖液E包含如下成分：

0.005～0.015MTris-鹽酸

0.0005～0.0015M EDTA。

二氧化硅結(jié)合柱是二氧化硅核酸結(jié)合柱(Qiagen,QIAamp Mini Spin Columns51304)。

步驟(1)中，所述離心的方法為：將樣品在1800～2000g、4℃條件下離心10min，將上清再在15000～16000g、4℃條件下離心10～15min，即可。優(yōu)選地，前一次離心的條件是：1900g、4℃離心10min；后一次離心的條件是：16000g、4℃離心10min。

步驟(2)中，每1ml上清中加入結(jié)合緩沖液A0.9ml，細(xì)胞裂解液100μl。；混勻后，在60℃放置30min

步驟(3)中，所述離心是在13000rpm離心1～2min。

步驟(3)中，用緩沖液B洗脫的方法是：加入750μl洗滌緩沖液B，13000rpm離心1min，棄去收集管，換上新的收集管。

步驟(5)中，每1ml洗脫液中加入結(jié)合緩沖液A0.9ml，混勻，在60℃放置30min。

步驟(7)中，用洗滌緩沖液D洗脫的方法是：加入洗滌緩沖液D，13000rpm離心1～2min。

步驟(7)中，用洗滌緩沖液E洗脫的方法是：加入洗滌緩沖液E，靜置5分鐘，13000rpm離心1min。

所述結(jié)合緩沖液A包含如下成分：

所述結(jié)合緩沖液A的pH為7.2～7.6，優(yōu)選為7.4。

所述細(xì)胞裂解液是濃度為20mg/ml的蛋白酶K溶液。

所述洗滌緩沖液B包含如下成分：

硫氰酸胍 120g

0.1MTris鹽酸 100ml

所述洗滌緩沖液B的pH為6.2～6.6，優(yōu)選為6.4。