[發明專利]一種從母體血漿中分離富集游離胎兒DNA的方法

有效

• 申請號: 201510075702.0
• 申請日: 2015-02-11
• 公開（公告）號: CN104862301B
• 公開（公告）日: 2017-11-14
• 發明（設計）人: 鄭良宏
• 申請（專利權）人: 廣州康睿生物醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙)51222
• 代理人: 李高峽,張娟

1.一種從母體血漿中分離富集游離胎兒DNA的方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）取母體血漿樣品，離心，得上清；

（2）每1ml上清中加入結合緩沖液A0.8~1ml、細胞裂解液50~150μl，混勻，在25℃~65℃條件下放置20~60min；

（3）加入到二氧化硅結合柱上，離心，用洗滌緩沖液B洗脫；

（4）再用選擇性洗滌緩沖液C洗脫，收集洗脫液；

（5）每1ml洗脫液中加入結合緩沖液A0.8~1ml，混勻，在25℃~65℃條件下放置20~60min；

（6）重復步驟（3）；

（7）用洗滌緩沖液D洗脫，再用洗脫緩沖液E洗脫，收集洗脫液，即可；

其中，結合緩沖液A包含如下成分：

硫氰酸胍 100~140g

0.1MTris鹽酸 80~120ml

0.2M EDTA 溶液 20~24ml

Triton X-100 2~3g；

其中，細胞裂解液是濃度為20 mg/ml的蛋白酶K溶液；

其中，洗滌緩沖液B包含如下成分：

硫氰酸胍 100~140g

0.1MTris鹽酸 80~120ml；

其中，選擇性洗滌緩沖液C由緩沖液B與5mol/L NaCl溶液以1:（2~4）v/v的比例混合而成；

其中，洗滌緩沖液D為含（5~15）mmol/LNaCl的（50%~90%）的乙醇溶液；

其中，洗脫緩沖液E包含如下成分：

0.005~0.015mol/L Tris-鹽酸

0.0005~0.0015mol/L EDTA

其余為水；

步驟（1）中，所述離心的方法為：將樣品在1800~2000g、4℃條件下離心10min，取上清再在15000~16000g、4℃條件下離心10~15min，即可。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）中，第一次離心的條件是：1900g、4℃離心10min；后一次離心的條件是：16000g、4℃離心10min。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2）中，每1ml上清中加入結合緩沖液A0.9ml，細胞裂解液100μl；混勻后，在60℃放置30 min。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（3）中，所述離心是在13000rpm 條件下離心1~2min。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（5）中，每1ml洗脫液中加入結合緩沖液A0.9ml，混勻，在60℃放置30 min。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述結合緩沖液A包含如下成分：

硫氰酸胍120g

0.1MTris鹽酸100ml

0.2M EDTA 溶液22ml

Triton X-1002.6g；

所述結合緩沖液A的pH為7.2~7.6 。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述結合緩沖液A的pH為7.4。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述洗滌緩沖液B包含如下成分：

硫氰酸胍 120g

0.1MTris鹽酸 100ml

所述洗滌緩沖液B的pH為6.2~6.6 。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：所述洗滌緩沖液B的pH為6.4。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述選擇性洗滌緩沖液C是由緩沖液B與5mol/L NaCl溶液以1:3 v/v的比例混合而成。

11.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述洗滌緩沖液D為含10mM NaCl的70%乙醇溶液。

12.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述洗脫緩沖液E包含如下成分：

0.001mol/LTris-鹽酸

0.0001mol/L EDTA

其余為水。