[發明專利]一種基于COII基因的非洲乳白蟻熒光定量PCR分子檢測方法

在審

• 申請號: 201510075573.5
• 申請日: 2015-02-12
• 公開（公告）號: CN104673909A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 張衛東;王嵐;權永兵;廖力;徐淼鋒;遲遠麗;黃永輝
• 申請（專利權）人: 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚志強

技術領域

本發明涉及生物物種分子診斷領域，具體的說是一種對非洲乳白蟻熒光定量PCR分子檢測鑒定方法，以及在該方法中應用到的檢測用探針和引物組合。

背景技術

白蟻(Termite)是等翅目(Isoptera:Rhinotermitidae)昆蟲的俗稱，世界范圍的經濟重要性昆蟲，生物量相當豐富，被世界昆蟲生理生態研究中心列為世界五大害蟲之一，具有分布廣、生活隱蔽、危害大、防治困難、能夠隨木材及其制品跨區域傳播等特點(呂俊峰等,2010)。目前全世界共有7科286屬2860余種。我國已記載的白蟻有476種(Zhonget?al,2002)，其中對人類社會、經濟、環境危害最嚴重為乳白蟻屬(CoptotermesWasmann,1896)，全世界有83種，我國共有24種(黃復生等,2000)。乳白蟻適應性強，常在朽木、建筑物中或地下筑巢，我國過去稱其為“家白蟻”。其分布廣，繁殖迅速，不僅危害農林作物，蛀食多種堅硬的木材，還為害含纖維素的木材加工品如紙、棉布、皮革制品等，甚至能危害地下通訊電纜等的塑料保護層。乳白蟻的危險性不僅表現在它能造成非常嚴重的經濟損失，更重要的是它在傳入后能在新的地域快速定殖、建群并繁殖、擴散，給傳入地帶來新的嚴重危害(周明華等,2002)。

分子生物技術在白蟻分類鑒定方面取得很多研究成果。隨機擴增多態性技術(Random?Amplified?Polymorphic?DNA,RAPD)由于對DNA模板純度要求較高，獲得的信息量偏少且重復性差，不適合作為白蟻分子鑒定的手段。限制性片段長度多態性分析(Restriction?Fragment?Length?Polymorphism,RFLP)雖然比較穩定、準確，重復性好，但操作起來非常繁瑣，且放射性污染嚴重，也不宜采用(Alam,et?al,2007；徐劉平等,2009)。Husseneder等(2005)應用簡單序列重復標記技術(Simple?Sequence?Repeats,SSR)對美國新奧爾良Armstrong公園的臺灣乳白蟻空間和社會組成，以及種群基因結構進行了描述。該技術對整個實驗操作過程的準確度和精確度要求非常高，稍許差錯就會對最終結果造成很大影響。以上技術手段在白蟻研究中進行了有益的探索，但對于白蟻分子分類鑒定、遺傳進化和系統發育的研究，目前仍未取得很好的成果，還需要更深入的探索研究。

NCBI(National?Center?for?Biotechnology?Information)，即美國國立生物技術信息中心，擁有世界上最全的生物分子信息，其中包括乳白蟻屬的基因序列。截止2015年2月6日，在NCBI網站中提交的乳白蟻屬分類單位39個，其中定名種類26個，未定名種13個。臺灣乳白蟻C.formosanus是目前NCBI中核苷酸序列最多的種，共有核苷酸序列1490條。其次為乳白蟻屬的模式種格斯特乳白蟻C.gestroi，現有序列282條。被用作標記基因最多的片段為COII和16S，其他分別是COI、12S和18S，為我們選擇遺傳標記提供了豐富的信息。Tokuda等(2012)在NCBI中提交了C.formosanus線粒體全基因組序列(序列號為AB626145～AB626147)，為基于分子信息學的乳白蟻屬近似種的修訂和隱含種類的發掘提供了堅實的基礎。

非洲乳白蟻學名是CoptotemessjostedtiHolmgre分布在利比里亞、塞內加爾、塞拉利昂、加納、尼日利亞、喀麥隆、剛果、安哥拉、烏干達、坦桑尼亞，該種乳白蟻是西非沿海各國危害建筑物的主要白蟻種類之一。兵蟻頭殼深黃褐色，上顎赤褐色，觸角色近于頭殼。頭殼被毛稀少，囟孔兩側各一根毛，前胸背板中區約6～8根毛。頭殼近卵圓形，頭指數為0.79～0.81，最寬處位于中段稍后，為上顎基寬的1.78～1.84倍；頭背緣自囟孔緩向頭頂拱起，再向后漸傾斜。囟孔圓拱形(高約0.11mm，寬約0.14mm)，近直立。觸角12節，上唇狹三角形。上顎細直，顎端尖而略彎，左上顎長為頭殼長的0.52～0.56。后頦腰區近后緣，腰指數0.62～0.67，前區扁平稍凹，寬狹于腰，最寬區稍拱起。前胸背板甚扁，寬為長的1.74倍～1.84倍，前緣中央淺凹入，前側角圓，兩側邊平行再急后傾，后緣中央稍凹。后脛長為頭寬的0.77～0.86。