[發明專利]MGMT基因啟動子甲基化檢測試劑和方法

在審

• 申請號: 201510074978.7
• 申請日: 2015-02-12
• 公開（公告）號: CN104726561A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發明（設計）人: 陳奕磊;林筱劍;王淑一
• 申請（專利權）人: 福州艾迪康醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州金道專利代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

技術領域

本發明屬生命科學和生物技術領域，是一種MGMT基因啟動子甲基化檢測試劑和方法。

背景技術

通過調整DNA修復機制來提高常規化療藥物療效是腫瘤研究的一個重要領域。O⁶-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)在修復O⁶-烷基鳥嘌呤損傷中的特殊作用機制及自殺性酶特性，使其在腫瘤早期診斷和預測腫瘤對烷化劑藥物敏感性中具備了重要意義。

MGMT作為一種DNA修復蛋白，能夠移除DNA上鳥嘌呤O⁶位點的能致突變毒性和細胞毒性的烷基化加合物，使損傷的鳥嘌呤恢復，從而能夠保護細胞對抗烷化基團的損害，而由啟動子甲基化調控的MGMT基因表觀沉默揭示了人類腫瘤發生的一個重要突變路徑：MGMT基因啟動子過甲基化導致MGMT表觀沉默,由烷化劑引起的O⁶-MeG加合物不能被移除,就會導致基因突變，有報道稱MGMT基因表觀沉默導致p53和K-ras基因的突變率增加可能在整個基因組從始至終地存在，并且受其影響的不僅僅是基因組穩定所必需的基因，還包括更多的基因，因此啟動子異常甲基化所致的基因沉默可能是腫瘤發生的一種早期事件。

此外，MGMT基因啟動子甲基化狀態也與烷化劑藥物敏感性有一定相關性。烷化劑替莫唑胺(TMZ)、雙氯乙基亞硝脲(BCNU)、嘧啶亞硝脲(ACNU)等作為化療藥物廣泛應用于治療人類腫瘤。這些烷化劑的一個重要作用位點為O⁶鳥嘌呤,而MGMT能夠迅速移除O⁶鳥嘌呤上烷基化合物使烷化劑殺腫瘤療效降低，導致腫瘤耐藥。有研究表明在腦膠質瘤中發現MGMT活性降低的患者對烷化劑藥物敏感性增強，隨后證實MGMT基因CpG島甲基化是MGMT在腦膠質瘤中缺失的最主要原因。MGMT基因甲基化的腦膠質瘤病人對烷化劑藥物BCNU和TMZ更為敏感，同時這類病人總生存率明顯改善，MGMT啟動子甲基化狀態與進行放療聯合TMZ化療的腦膠質瘤患者中長期生存率呈正相關。所以，MGMT甲基化具有預測人類腫瘤對烷化劑化療藥物反應性的潛在價值，當然這不僅僅是限于預測腦膠質瘤對BCNU和TMZ等烷化劑反應性，還可應用于其它固體瘤和血液腫瘤。綜上所述，檢測MGMT基因啟動子甲基化狀態有可能成為早期腫瘤形成及預測腫瘤對烷化劑化療藥物敏感性的分子標記。

目前對于MGMT啟動子甲基化檢測的常規方法有：甲基化特異性PCR(MSP)、亞硫酸氫鹽測序PCR(BSP)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(MS-HRM)、熒光定量法。其中MSP法是使用PCR擴增檢測來判斷樣本是否存在甲基化，該法實用且普遍，但不能做到定量檢測，并且存在較高的假陽性風險；BSP法主要是通過PCR聯合sanger測序技術來檢測甲基化狀態，但由于其操作繁瑣，因此不適合大批量檢測，同時挑選克隆的數目可能會影響檢測結果，因此BSP只能算是半定量法；MS-HRM是通過將單堿基序列的差異轉變成熔解曲線的差異，從而判斷是否存在甲基化，這種方法對儀器的要求頗高，需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀，同時該法只能分析檢測片段整體甲基化狀態，而不能明確每個CpG位點的甲基化狀態；熒光定量法是基于MSP開發的技術，主要是在檢測中加入了TaqMan探針，從而保證了較高的靈敏度和準確度，但其對于多個甲基化位點的檢測，也只能做到整體化分析，同時探針成本較高，因此該法較適用于少數位點大量樣本檢測。

本發明采用的檢測方法為PCR聯合焦磷酸測序技術。目前，焦磷酸測序法已被認為是甲基化檢測的金標準。焦磷酸測序技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，其原理是：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA?polymerase)、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。依據這一原理，在檢測時，只需根據單個所檢位點內C和T的熒光信號強度，即可確定該位點的甲基化狀態，使得檢測結果更加直觀。因此該方法不僅可定性，也能實現定量，甚至結合相關軟件可以精確的分析所檢片段區域的甲基化狀態。同時，焦磷酸測序儀可在30min左右內可完成96例樣本的測序，因此具備了準確性高、檢測通量高、檢測周期短等優勢。