[發明專利]一種人工角膜的制備方法

有效

• 申請號: 201510074946.7
• 申請日: 2015-02-12
• 公開（公告）號: CN104665956B
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 劉靖;劉祖國;李志寒;李潔
• 申請（專利權）人: 廈門大開醫療器械有限公司
• 主分類號: A61F2/14
• 分類號: A61F2/14
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 楊依展

本發明公開了一種人工角膜的制備方法，包括如下步驟：(1)收集適齡豬眼球；(2)刮除上述豬眼球的角膜上皮細胞和角膜內皮細胞，保留前彈力層，使用板層刀制備板層角膜，鉆取指定大小角膜片；(3)將步驟(2)獲得的角膜片置于液氮8～35分鐘，取出后在常溫常壓下將角膜片緩慢復溫至室溫，重復4～12次；(4)將步驟(3)凍融處理后的角膜片置于生理鹽水中進行超聲波清洗，超聲工作頻率20～250kHz，超聲時間15～65分鐘；(5)將超聲處理后的角磨片置于緩沖體系中用核酸內切酶酶解角膜基質細胞DNA，即得所述人工角膜。本發明的制備方法制備的人工角膜的天然膠原纖維之間的空隙有利于誘導受體角膜細胞的生長和神經纖維的生長，促進供體角膜修復和重建。

技術領域

本發明屬于技術領域，具體涉及一種人工角膜的制備方法。

背景技術

角膜位于眼球最前端，是光線穿過的第一個屈光間質，其透明度是保證良好的視功能的第一要素。因此，人工角膜不同于其他組織工程產品，通過不同方法制備后，不僅需要保持其細胞外支架良好的力學性能，同時對于支架材料的透明度要求也很高。

隨近些年組織工程技術的發展，各種“人造器官”如異種心瓣膜、皮膚等異種器官在人體移植上的成功。對人工角膜的研究帶來新的理念和巨大的啟示。最早于本世紀初由國內學者提出由動物角膜作為組織工程的天然生物材料，以替代先期的化學材料。

從2005年開始，由國內研究人員(包括本發明人)提出一系列重大研究成果，特別是近些年，國內研究人員發現，在各種不同動物角膜中，豬角膜與人角膜最為接近，是人角膜的最佳替代。國內研究人員將人工角膜的研究集中在豬角膜方向上。

2008年3月15日公開發表的論文《去細胞豬角膜基質這支架材料組織工程角膜的構建與應用》公開了一種以豬角膜為生物材料的人工角膜制備方法。該方法包括豬角膜的預處理及角膜片制備、離子水清洗、—80℃凍融處理、以及酶解脫細胞處理。但是，該公開論文所采用的技術方案存在有如下不可避免的缺陷：

其一、預處理后所獲得的角膜片的結構不合理，角膜片的基質層厚度僅為角膜基質層的厚度的一半，不能滿足移植后人自體細胞有足夠的生長空間，不能生長成正常的角膜結構。

其二、在制備過程中，對角膜進行了反復的溶脹處理，溶脹后的角膜片為正常角膜的10倍，角膜內含水量增大了10倍。角膜片內基質層的膠原結構過渡松解而呈極不穩定的狀態，從而破壞了角膜基質層膠原纖維的規則排列結構。

其三、在凍融處理時采用的相對低的冷凍溫度和相對長的冷凍時間，在角膜片含水量較大的狀態下會大大地增大冷凍時所產生的冰晶體，從而增大對角膜基質層的膠原排列的破壞程度。

其四、在酶解處理時，采用的胰酶會破壞角膜ECM(細胞外基質)結構，即規則的膠原排列結構，而角膜內的膠原排列結構是角膜正常生理功能“透明”重要保證，一旦破壞將喪失角膜的生理功能。

其五、采用的DNA-RNA酶，不能確保該酶能相對準確地作用于角膜細胞的特定位置，酶解效率低下，因此，不能達到較為理想的脫細胞效果。此外，對比文件使用的反應溫度將加重細胞內溶酶體對角膜細胞外基質成分的破壞，膠原纖維排列也受到影響，對角膜透明度造成嚴重影響，可通過與對比文件2的附圖的對比中得到效果的比較。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術缺陷，提供一種人工角膜的制備方法。，在去除豬角膜的中活細胞的同時最大程度地保持了天然角膜膠原纖維的排列，以保證人工角膜的透明；

本發明的目的之二在于提供一種人工角膜的制備方法，人工角膜的天然膠原纖維之間的存在合理的空隙，使之有利于誘導受體角膜細胞的生長和神經細胞的生長，促進供體角膜修復和重建。

本發明的具體技術方案如下：

一種人工角膜的制備方法，包括如下步驟：

(1)選料：收集4～12月齡豬眼球；