[發明專利]一種人工角膜的制備方法

有效

• 申請號: 201510074946.7
• 申請日: 2015-02-12
• 公開（公告）號: CN104665956B
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 劉靖;劉祖國;李志寒;李潔
• 申請（專利權）人: 廈門大開醫療器械有限公司
• 主分類號: A61F2/14
• 分類號: A61F2/14
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 楊依展

1.一種人工角膜的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)選料：收集4～12月齡豬眼球；

(2)預處理：刮除上述豬眼球的角膜上皮細胞和角膜內皮細胞，保留完整的角膜前彈力層，鉆取指定大小角膜片；

(3)凍融：在常溫常壓下，將步驟(2)獲得的角膜片置于液氮8～35分鐘，取出后在常溫常壓下將角膜片緩慢復溫至室溫，重復4～12次；

(4)超聲：將步驟(3)凍融處理后的角膜片置于生理鹽水中進行常溫常壓下的超聲波清洗，超聲工作頻率20～250kHz，超聲時間15～65分鐘；

(5)酶降解：在常溫常壓下，將超聲處理后的角磨片置于緩沖液中用核酸內切酶酶解角膜基質細胞DNA，即得所述人工角膜，該緩沖液的以培養液為溶劑，還包括0.1～0.5％的非必需氨基酸、2～3％的酸堿調節劑、10～60mol/L的無機陽離子和10～60mol/L的無機陰離子，pH值為7.0～7.5，滲透壓為330～390mOsm/L，核酸內切酶的濃度為5～55μg/mL，酶解時間20～230分鐘，核酸內切酶為限制性核酸酶I或限制性核酸酶II，所述培養液為SFM，MEM，DMEM，BME或HAMF12，所述無機陽離子為鈉離子、鋰離子、鋁離子、鈣離子和鎂離子中的至少一種，所述無機陰離子為氯離子、氫氧根離子、碳酸根離子、磷酸根離子、磷酸氫根離子和硫酸根離子的至少一種，所述非必需氨基酸為甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸和組氨酸中的至少一種。

2.如權利要求1所述的一種人工角膜的制備方法，其特征在于：所述步驟(3)為：在常溫常壓下，將步驟(2)獲得的角膜片置于液氮10～30分鐘，取出后在常溫常壓下將角膜片緩慢復溫至室溫，重復5～10次。

3.如權利要求1所述的一種人工角膜的制備方法，其特征在于：所述步驟(4)為：將步驟(3)凍融處理后的角膜片置于生理鹽水中進行常溫常壓下的超聲波清洗，超聲工作頻率20～200kHz，超聲時間20～60分鐘。

4.如權利要求1所述的一種人工角膜的制備方法，其特征在于：所述步驟(5)為：該緩沖液的以培養液為溶劑，還包括0.1～0.5％的非必需氨基酸、2～3％的酸堿調節劑、10～50mol/L的無機陽離子和10～50mol/L的無機陰離子，pH值為7.2～7.4，滲透壓為350～380mOsm/L，核酸內切酶的濃度為5～50μg/mL，酶解時間20～200分鐘。

5.如權利要求1所述的一種人工角膜的制備方法，其特征在于：所述酸堿調節劑為碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖對、磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖對、HEPES或硼酸-硼砂緩沖對。