[發明專利]一種重組畢赤酵母工程菌及其生產方法在審

申請號：	201510072899.2	申請日：	2015-02-11
公開（公告）號：	CN104651383A	公開（公告）日：	2015-05-27
發明（設計）人：	胡洪;戴四發;聞愛友;白晰;殷宗俊;丁月云;王立克;華金玲	申請（專利權）人：	安徽科技學院
主分類號：	C12N15/56	分類號：	C12N15/56;C12N1/19;C12N15/81;A23K1/00;C12R1/84
代理公司：	北京雙收知識產權代理有限公司 11241	代理人：	王菊珍
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種重組酵母工程及其生產方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及基因工程領域，特別是涉及一種重組畢赤酵母工程菌及其生產方法。

背景技術

半纖維素是僅次于纖維素含量的第二豐富的可利用自然資源。木聚糖是植物性材料細胞壁中半纖維素的重要組成成分，是存在于木質素和纖維素的下面，并緊密地與木質素和纖維素結合在一起。木聚糖是一類多聚五碳糖，主要由多個相同或不同種類的五碳糖通過1,4-β-D-木糖苷鍵連接起來，是飼料中的主要抗營養因子之一。木聚糖酶(xylanase)是一類糖苷水解酶，能夠催化木聚糖分子內1,4-β-D-木糖苷鍵的內切水解，其主要水解產物是木二糖和木二糖以上的低聚木糖，還有少量木糖和阿拉伯糖，這一作用既降低木聚糖的抗營養作用，又將其轉化為營養性物質。

大量研究表明，木聚糖酶能提高各種類型飼料的利用率，降低胃腸道食糜的粘性，增進畜禽健康，其在飼料資源開發和提高廉價副產品的利用率方面，具有廣闊的前景。此外木聚糖酶在紙漿工業中，被用作紙漿生物漂白；木聚糖的水解產物(木糖和低聚木糖)可應用在食品行業、比如作為增稠劑、脂肪替代物或抗冷凍食品添加劑；在制藥工業中木聚糖與其他物質結合使用，可遲緩藥物成分的釋放；還可應用于釀酒工業和能源轉化方面。可見木聚糖酶具有巨大的應用價值和研究前景。

國外對木聚糖酶的研究工作開展較早，并且早已進入工業化生產階段，而我國研究較晚，目前還沒有能夠用于規模化生產木聚糖酶的菌株。木聚糖酶主要通過微生物發酵產生，包括細菌、放線菌、真菌以及某些酵母等，絲狀真菌引起人們的特別注意。這主要是因為，絲狀真菌能夠將產生的木聚糖酶分泌到培養基中，并且木聚糖酶的產生量較其他真菌和細菌更高。

雖然木聚糖酶的應用領域十分廣泛，但由于天然菌株中木聚糖酶產量較低、生產成本昂貴、分離的聚糖酶活性不高、產酶效率不好，酶學性質沒有達到工業應用要求，這些都制約著木聚糖酶的應用和發展。隨著現代分子生物學技術的發展，通過基因工程技術，構建具有潛在應用價值的高效木聚糖酶基因工程菌株，進行密碼子優化，提高木聚糖酶的表達水平，以期在工業生產中推廣應用。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種穩定的、可以大量分泌木聚糖酶的重組畢赤酵母工程菌及其生產方法。

一種密碼子優化的里氏木霉菌木聚糖酶的基因，所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示。

一種重組畢赤酵母工程菌，其包括本發明所述的基因序列。

本發明所述重組畢赤酵母工程菌在動物營養與飼料工業領域中的應用，所述重組畢赤酵母工程菌能大量分泌木聚糖酶，反應溫度范圍為40-60℃，pH值范圍為4-8。

一種重組畢赤酵母工程菌的生產方法，包括如下步驟：

(1)根據畢赤酵母偏愛密碼子，將里氏木霉木聚糖酶基因進行同義突變，全部突變為畢赤酵母偏愛密碼子，突變后的基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示；

(2)利用全基因合成技術合成優化后的木聚糖酶基因，與pMD20-T載體相聯，構建克隆載體pMD20T-Xynopti；

(3)重組表達載體構建：將回收得到的角蛋白酶基因片段經EcoRI和Kpn?I雙酶切后，與經同樣限制酶酶切的質粒pPICZαA相連，構建表達載體pPICZαA-Xynopti；

(4)畢赤酵母宿主的轉化：重組表達質粒pPICZαA-Xynopti經電轉化野生型畢赤酵母X-33后，并篩選出陽性轉化子進行誘導表達；

(5)陽性轉化子誘導培養：從平板上挑取單酵母轉接于BMGY培養基中培養16-18h后轉入BMMY培養基中進行誘導表達，培養物經離心后分析得到含重木聚糖酶的上清，利用SDS-PAGE對其進行檢測；

(6)采用重組畢赤酵母工程菌小規模發酵生產木聚糖酶。