[發(fā)明專利]一種重組畢赤酵母工程菌及其生產(chǎn)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510072899.2
• 申請日: 2015-02-11
• 公開（公告）號: CN104651383A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡洪;戴四發(fā);聞愛友;白晰;殷宗俊;丁月云;王立克;華金玲
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽科技學院
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N1/19;C12N15/81;A23K1/00;C12R1/84
• 代理公司: 北京雙收知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11241
• 代理人: 王菊珍

1.一種密碼子優(yōu)化的里氏木霉菌木聚糖酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示。

2.一種重組畢赤酵母工程菌，其特征在于，其包括權(quán)利要求1所述的基因序列。

3.權(quán)利要求2所述重組畢赤酵母工程菌在動物營養(yǎng)與飼料工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用，所述重組畢赤酵母工程菌能大量分泌木聚糖酶，反應(yīng)溫度范圍為40-60℃，pH值范圍為4-8。

4.一種重組畢赤酵母工程菌的生產(chǎn)方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)根據(jù)畢赤酵母偏愛密碼子，將里氏木霉木聚糖酶基因進行同義突變，全部突變?yōu)楫叧嘟湍钙珢勖艽a子，突變后的基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示；

(2)利用全基因合成技術(shù)合成優(yōu)化后的木聚糖酶基因，與pMD20-T載體相聯(lián)，構(gòu)建克隆載體pMD20T-Xynopti；

(3)重組表達載體構(gòu)建：將回收得到的角蛋白酶基因片段經(jīng)EcoR?I和Kpn?I雙酶切后，與經(jīng)同樣限制酶酶切的質(zhì)粒pPICZαA相連，構(gòu)建表達載體pPICZαA-Xynopti；

(4)畢赤酵母宿主的轉(zhuǎn)化：重組表達質(zhì)粒pPICZαA-Xynopti經(jīng)電轉(zhuǎn)化野生型畢赤酵母X-33后，并篩選出陽性轉(zhuǎn)化子進行誘導表達；

(5)陽性轉(zhuǎn)化子誘導培養(yǎng)：從平板上挑取單酵母菌落轉(zhuǎn)接于BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-18h后轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中進行誘導表達，培養(yǎng)物經(jīng)離心后分析得到含重木聚糖酶的上清，利用SDS-PAGE對其進行檢測；

(6)采用重組畢赤酵母工程菌小規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組畢赤酵母工程菌的生產(chǎn)方法，其特征在于：步驟(6)中采用重組畢赤酵母工程菌小規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法在30L液體發(fā)酵系統(tǒng)中進行，過程分為三階段進行：

第一階段：接種步驟(5)中的陽性轉(zhuǎn)化子單菌落至裝有25mL?YPD培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，250r/min，29℃振蕩培養(yǎng)18h，作為一級種子發(fā)酵液；

第二階段：取所述一級種子發(fā)酵液20ml接種于裝有400mL?YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶中，250r/min，29℃振蕩培養(yǎng)18h，作為二級種子發(fā)酵液；

第三階段：

以2％的接種量接種到裝有17L甘油-BSM培養(yǎng)基中的30L發(fā)酵罐中，320r/min，29℃的條件下培養(yǎng)，全程用28％氨水進行pH值的調(diào)節(jié)，保持在5.3；所述甘油-BSM培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量百分比的成分：甘油：5％；硫酸銨：4％；K₂PO₄：0.5％；CaSO₄·2H₂O：0.1％；K₂SO₄：1.6％；MgSO₄·7H₂O：1.5％；KOH：0.15％；PTM1：0.43％；0.02％生物素：0.6％；消泡劑：0.1％；增效劑：0.1％；上述成分均溶于水中形成所述甘油-BSM培養(yǎng)基；

培養(yǎng)24h后，進行補料，補料體積為3.4L，直至補料結(jié)束，補料配方為50％甘油；1.5％PTM1；甘油和PTM1溶于水中形成所述補料；

待碳源耗盡，即DO值迅速上升時，饑餓1h后開始誘導，誘導過程中使用的誘導劑配方為100％甲醇，其中還有質(zhì)量百分比為1.5％的PTM1和1％的0.02％生物素。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組畢赤酵母工程菌的生產(chǎn)方法，其特征在于：步驟(4)中所述電轉(zhuǎn)化野生型畢赤酵母X-33具體包括如下步驟：

A)將10～20μg的線性化重組質(zhì)粒與80μL上述細胞懸液混合均勻，轉(zhuǎn)至預(yù)冷的2mm直徑電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴5min；

B)設(shè)置參數(shù)25μF、電壓為1500V電擊轉(zhuǎn)化；

C)電擊結(jié)束后，迅速加入1ml預(yù)冷的1mol/L山梨醇，將菌體混勻后轉(zhuǎn)至1.5mL的EP管中，于30℃培養(yǎng)箱放置1～2h；

D)取200～300μL轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于YPD+Zeocin平板上，30℃培養(yǎng)2～3天，直至單菌落出現(xiàn)。