[發明專利]檢測細胞外基質MMP13的BRET探針、基因、表達載體和構建方法

在審

• 申請號: 201510072880.8
• 申請日: 2015-02-10
• 公開（公告）號: CN104788569A
• 公開（公告）日: 2015-07-22
• 發明（設計）人: 王大平;梁宇杰;段莉;李子剛
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C09K11/06;C12Q1/37;C12N15/62;C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

1.一種檢測細胞外基質MMP13的BRET探針，包括BRET生物發光供體和BRET受體熒光蛋白，其特征在于，所述BRET生物發光供體和BRET受體熒光蛋白之間通過MMP13特異性識別降解的多肽底物連接；

其中，所述BRET生物發光供體為具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的Rluc8蛋白，所述BRET受體熒光蛋白為黃色熒光蛋白。

2.如權利要求1所述的檢測細胞外基質MMP13的BRET探針，其特征在于，所述多肽底物具有序列表SEQ.ID.No.2氨基酸序列。

3.如權利要求2所述的檢測細胞外基質的MMP13的BRET探針，其特征在于，所述黃色熒光蛋白為YFP、cpYFP、cpVenus中的一種。

4.一種權利要求1所述的檢測細胞外基質MMP13的BRET探針的編碼基因，其特征在于，包括順次連接的BRET生物發光供體編碼基因、MMP13特異性識別降解的多肽底物編碼基因和BRET受體熒光蛋白編碼基因；

所述BRET生物發光供體編碼基因為具有序列表SEQ.ID.No.3堿基序列的Rluc8蛋白編碼基因。

5.如權利要求4所述的檢測細胞外基質MMP13的BRET探針的編碼基因，其特征在于，所述多肽底物編碼基因為具有序列表SEQ.ID.No.4堿基序列。

6.如權利要求4所述的檢測細胞外基質MMP13的BRET探針的編碼基因，其特征在于，

所述BRET受體熒光蛋白編碼基因為具有序列表SEQ.ID.No.5堿基序列的YFP基因；

或，所述BRET受體熒光蛋白編碼基因為具有序列表SEQ.ID.No.6堿基序列的cpYFP基因；

或，所述BRET受體熒光蛋白編碼基因為具有序列表SEQ.ID.No.7堿基序列的cpVensu基因。

7.一種包含權利要求4至6任一項所述的檢測細胞外基質MMP13的BRET探針的編碼基因的真核細胞表達質粒。

8.如權利要求7所述的包含檢測細胞外基質MMP13的BRET探針的編碼基因的真核細胞表達質粒，所述真核細胞表達載體為pDisplay載體。

9.一種權利要求8所述的包含檢測細胞外基質MMP13的BRET探針的編碼基因的表達質粒的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

將具有序列表SEQ.ID.No.3的堿基序列的Rluc8蛋白編碼基因克隆至質粒pDisplay的多克隆位點，得到Rluc8表達質粒；

將黃色熒光蛋白的編碼基因克隆至所述Rluc8表達質粒中與Rluc8蛋白編碼基因末端銜接，形成生物發光與熒光蛋白融合的表達質粒；

將具有序列表SEQ.ID.No.4堿基序列的多肽底物編碼基因插入至所述融合體表達質粒中Rluc8蛋白編碼基因和黃色熒光蛋白的編碼基因之間。

10.如權利要求9所述的包含檢測細胞外基質MMP13的BRET探針的編碼基因的表達載體的構建方法，其特征在于，

將所述具有序列表SEQ.ID.No.3的堿基序列的Rluc8蛋白的編碼基因克隆至質粒pDisplay的多克隆位點步驟包括：

以具有序列表SEQ.ID.No.8堿基序列的用RLuc8-F上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.9堿基序列的下游引物RLuc8-R擴增所述Rluc8蛋白編碼基因；

分別將Rluc8蛋白編碼基因的擴增產物和pDisplay質粒用BgIII和PstI進行雙酶切后，進行連接；

和/或，將所述黃色熒光蛋白的編碼基因克隆至所述Rluc8表達質粒中與Rluc8蛋白編碼基因末端銜接步驟包括：

將所述黃色熒光蛋白的編碼基因PCR擴增；其中，

當所述黃色熒光蛋白為具有序列表SEQ.ID.No.5堿基序列的YFP基因時，PCR中采用的引物為具有序列表SEQ.ID.No.10堿基序列的上游引物YFP-F和具有序列表SEQ.ID.No.11堿基序列的下游引物YFP-R；

當所述黃色熒光蛋白為具有序列表SEQ.ID.No.6堿基序列的cpYFP基因時，PCR中采用的引物為具有序列表SEQ.ID.No.12堿基序列的上游引物cpYFP-F和具有序列表SEQ.ID.No.13堿基序列的下游引物cpYFP-R；

當所述黃色熒光蛋白為具有序列表SEQ.ID.No.7堿基序列的cpVensu基因時，PCR中采用的引物為具有序列表SEQ.ID.No.14堿基序列的上游引物cpVensu-F和具有序列表SEQ.ID.No.15堿基序列的下游引物cpVensu-R；

分別將Rluc8蛋白編碼基因的擴增產物和Rluc8表達質粒用HindIII和SalI進行雙酶切后，進行連接；

和/或，將所述具有序列表SEQ.ID.No.4堿基序列的肽段底物編碼基因克隆插入至所述融合體表達質粒中Rluc8蛋白編碼基因和黃色熒光蛋白的編碼基因之間步驟包括：

將具有序列表SEQ.ID.No.16堿基序列的多肽底物的編碼基因引物和融合體表達質粒分別用PstI和HindIII雙酶切后，進行連接。