[發明專利]檢測細胞外基質MMP13的BRET探針、基因、表達載體和構建方法

在審

• 申請號: 201510072880.8
• 申請日: 2015-02-10
• 公開（公告）號: CN104788569A
• 公開（公告）日: 2015-07-22
• 發明（設計）人: 王大平;梁宇杰;段莉;李子剛
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C09K11/06;C12Q1/37;C12N15/62;C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種檢測細胞外基質MMP13的BRET探針、基因、表達載體和構建方法。

背景技術

基質金屬蛋白酶(Matrix?metallo?proteinases，MMPs)是一組依賴Zn2+依賴的細胞外酶，廣泛存在于各結締組織中，在細胞外基質的降解中起重要作用。其中，MMP13又稱為膠原酶-3，它是基質金屬蛋白酶(MMPs)家族中重要的降解酶，能夠特異性地降解膠原分子中三維螺旋結構的酶，其對于H型膠原的降解效率是所有基質蛋白酶中最高的。

MMP13主要由滑膜細胞、軟骨細胞、中性粒細胞等產生，主要通過破壞H型膠原之間的肽鏈而達到裂解軟骨的目的，因此在軟骨中MMP13表達水平升高是導致骨關節炎(OA)節軟骨退變的主要因素之一。并且進一步在反復的驗證之后，骨關節炎患者中MMP13蛋白比正常人高十倍，且表達量隨著骨性關節炎的進展而逐漸增加，MMP13逐漸成為OA診斷和治療的一項生理性指標，并且可能為OA的治療提供一個新的靶點。

而現有的MMP13的檢測方法，最常用的是雙抗體夾心法測定，受限于抗體的特異結合性以及檢測靈敏度的限制，且操作步驟過程繁瑣，并且無法檢測到活性MMP13的含量；并且檢測的過程中都需要損傷細胞，不適用于活體的蛋白酶的實時動態監測。

發明內容

本發明實施例的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種能夠在真核細胞膜表面表達的用于檢測細胞外基質MMP13的BRET探針、基因、表達載體和構建方法。

為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下：

一種檢測細胞外基質MMP13的BRET探針，包括BRET生物發光供體和BRET受體熒光蛋白，所述BRET生物發光供體和BRET受體熒光蛋白之間通過MMP13特異性識別降解的多肽底物連接；

其中，所述BRET生物發光供體為具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的Rluc8蛋白，所述BRET受體熒光蛋白為黃色熒光蛋白。

本發明構建的上述探針，探針自身的供體和受體熒光蛋白之間通過一可被MMP13特異性識別降解多肽底物連接產生BRET，當多肽底物被MMP13特異性識別降解之后，BRET現象消失，只能檢測到供體蛋白底物發出的發射光產生熒光信號變化，從而實現檢測目的；并且Rluc8蛋白的C端融合了含有血小板源生長因子受體(PDGFR)的跨膜區域，因此能錨定在細胞膜的表面，從而可以在不損傷細胞的情況下進行活體檢測，同時還具有更高的靈敏度。

本發明進一步還提出編碼上述檢測細胞外基質MMP13的BRET探針的基因，以及該編碼基因在真核細胞內進行表達的表達載體；其中，

編碼基因包括順次連接的BRET生物發光供體編碼基因、MMP13特異性識別降解的多肽底物編碼基因和BRET受體熒光蛋白編碼基因；所述BRET生物發光供體編碼基因為具有序列表SEQ.ID.No.3堿基序列的Rluc8蛋白編碼基因。

針對本發明中真核表達載體的實施，本發明進一步還提出上述表達載體的構建方法，包括如下步驟：

將具有序列表SEQ.ID.No.3的堿基序列的Rluc8蛋白編碼基因克隆至質粒pDisplay的多克隆位點，得到Rluc8表達質粒；

將黃色熒光蛋白的編碼基因克隆至所述Rluc8表達質粒中與Rluc8蛋白編碼基因末端銜接，形成熒光融合體表達質粒；

將具有序列表SEQ.ID.No.4堿基序列的多肽底物編碼基因插入至所述融合體表達質粒中Rluc8蛋白編碼基因和黃色熒光蛋白的編碼基因之間。

附圖說明

下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中：

圖1為本發明實施例用于檢測細胞外基質的MMP13的BRET探針示意圖；

圖2為圖1的BRET探針中多肽底物被MMP13特異性識別降解BRET小時示意圖；

圖3為本發明實施例質粒pDisplay克隆Rluc8蛋白編碼基因后的質粒圖譜；

圖4為圖3中質粒進一步克隆黃色熒光蛋白編碼基因后的質粒圖譜；

圖5為圖4中質粒進一步插入多肽底物編碼基因后的質粒圖譜；

圖6為激光共聚焦顯微鏡下的細胞膜表面、單獨的BRET探針和BRET探針結合表達定位于細胞膜上的熒光對照圖；