[發明專利]大黃魚白細胞介素8基因大腸桿菌表達產物及制備與應用

在審

• 申請號: 201510069252.4
• 申請日: 2015-02-10
• 公開（公告）號: CN104611287A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發明（設計）人: 陳新華;母尹楠;敖敬群
• 申請（專利權）人: 國家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C07K14/54;C12N15/24;C12N15/70;C07K1/22;A61K38/20;A61P37/04;C12R1/19
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

1.可高效表達大黃魚白細胞介素8基因的大腸桿菌工程菌，其特征在于為大腸桿菌(Escherichia?coli)BL21/pET-His-IL-8，已于2015年1月21日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M?2015053。

2.大黃魚白細胞介素8基因大腸桿菌表達產物，其特征在于為分子量約10kDa的大黃魚IL-8重組蛋白。

3.大黃魚白細胞介素8基因的cDNA序列及推斷的氨基酸序列如下：

其中，下劃線部分為預測的大黃魚IL-8信號肽；陰影部分標示推斷的大黃魚IL-8成熟肽序列；星號表示終止密碼子。

4.如權利要求2所述大黃魚白細胞介素8基因大腸桿菌表達產物的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)克隆大黃魚IL-8基因全長cDNA序列，再采用PCR技術擴增出編碼第23～99位氨基酸的大黃魚IL-8成熟肽基因片段；

2)將步驟1)得到的大黃魚IL-8成熟肽基因片段克隆到大腸桿菌表達載體pET-His，得到含大黃魚IL-8基因片段的重組表達載體pET-His-IL-8；

3)將重組表達載體pET-His-IL-8轉化大腸桿菌BL21菌株，經氨芐青霉素篩選及測序鑒定后，獲得含有大黃魚IL-8基因片段的大腸桿菌(Escherichia?coli)BL21/pET-His-IL-8；同時，表達載體pET-His轉化大腸桿菌(Escherichia?coli)BL21/pET-His-IL-8，獲得的大腸桿菌(Escherichia?coli)BL21/pET-His-IL-8作為對照菌株；

4)將步驟3)獲得的大腸桿菌(Escherichia?coli)BL21/pET-His-IL-8在LB培養基中經IPTG誘導、振蕩培養，將培養物離心收集菌體，Buffer?A重懸后，超聲破碎，分別收集菌體裂解液上清和菌體裂解液沉淀，經聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE分析證明大黃魚IL-8重組蛋白以包涵體形式表達；

5)利用鎳離子鰲合親和層析介質(Ni-NTA)純化大黃魚IL-8重組蛋白：離心收集大腸桿菌(Escherichia?coli)BL21/pET-His-IL-8培養物中菌體，用包涵體洗滌液重懸菌體，第1次超聲破碎，離心收集沉淀，再用包涵體裂解液重懸沉淀，第2次超聲破碎，離心收集上清后上柱，4℃結合2h，用雜蛋白洗滌液洗柱，再用尿素洗柱，最后用變性蛋白洗脫液洗脫，獲得大黃魚IL-8重組蛋白，純化后的大黃魚IL-8重組蛋白分別經緩沖液B、緩沖液C、緩沖液D進行3步透析，即得到具有生物學活性的大黃魚IL-8重組蛋白；緩沖液B的組成為：3M尿素、20mM?Tris-HCl、150mM?NaCl、0.25M咪唑、0.1mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM還原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％Tween?20；緩沖液C的組成為：1M尿素、20mM?Tris-HCl、150mM?NaCl、0.125M咪唑、0.1mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM還原型谷胱甘肽、5％甘油和0.005％Tween?20；緩沖液D的組成為：20mM?Tris-HCl、150mM?NaCl和5％甘油。

5.如權利要求4所述大黃魚白細胞介素8基因大腸桿菌表達產物的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述LB培養基的組成為：10g/L蛋白胨、5g/L酵母抽提物、10g/L氯化鈉；所述IPTG的摩爾濃度可為0.1mM；所述振蕩培養的條件可于37℃振蕩培養4h。

6.如權利要求4所述大黃魚白細胞介素8基因大腸桿菌表達產物的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述Buffer?A的組成為：20mM?Tris-HCl、150mM?NaCl、0.5％Triton?X-100和30mM咪唑，pH?7.9。

7.如權利要求4所述大黃魚白細胞介素8基因大腸桿菌表達產物的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所述包涵體洗滌液的組成為：2M尿素、20mM?Tris-HCl、150mM?NaCl、1mM?EDTA和0.5％Triton?X-100，pH?7.9；所述第1次超聲破碎的時間可為10min。