[發明專利]一種金屬離子固定化親和磁球的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201510069196.4
• 申請日: 2015-02-02
• 公開（公告）號: CN104667899A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 張維冰;張磊;陳雅靜;高小迪;張凌怡
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: B01J20/286
• 分類號: B01J20/286;B01J20/30;G01N1/40
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

【技術領域】

本發明涉及親和磁球技術領域，具體地說，是一種金屬離子固定化親和磁球的制備方法及應用。

【背景技術】

1975年，Porath等利用亞氨基乙二酸(IDA)作為配體固定在以瓊脂糖為基質的填料上利用IDA與過渡金屬銅、鎳、鈷或鋅離子的螯合作用，發展了一種IMAC(Immobilized?Metal-ion?affinity?chromatography)方法，對表面帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白進行吸附純化。這種利用螯合金屬與特殊蛋白相互作用而對蛋白進行富集純化的方法稱為固定金屬離子親和色譜(IMAC)。

固定金屬離子親和色譜法對蛋白的富集能力的強弱與基體，配體和金屬離子的種類有著重要的關系，配體中與金屬離子作用位點及和特異性蛋白的結合能力直接影響著多肽或蛋白的富集效果。常用的基質有大孔硅膠，交聯瓊脂糖和交聯葡聚糖以及有機聚合物TSK-gel?G500PW。硅膠載體剛性好，分離效率高，但在高pH下易溶解，低pH下易產生硅羥基。TSK的機械強度介于硅膠和瓊脂糖或葡聚糖之間，但與金屬螯合配體結合不牢固，使用時金屬離子易泄露。配體的作用是將金屬離子固定在基質上，為此配體既含能與基質共價鍵合的活性基團如-N、-OH、-Cl等，又有能與金屬離子配位的多個配位原子。常用的配體主要是亞氨基二乙酸，氮基三乙酸，N，N，N′-三(羧甲基)乙烯二胺等。固定金屬離子通常為具有d層空價電子軌道的過渡金屬如Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺等，它們與配體形成可與蛋白質結合的金屬螯合配體。

【發明內容】

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種以磁性無機物四氧化三鐵為核，雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的核殼材料，以及將其應用于對特異性多肽或蛋白進行富集檢測的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種金屬離子固定化親和磁球的制備方法，其特征在于，其具體步驟為：

第一、2.0～3.0g的三氯化鐵和90～110mL的乙二醇和7.0～7.5g的無水乙酸鈉進行均勻混合，在150～250℃進行高溫水解反應，得到四氧化三鐵磁球；

第二、將200～250mg四氧化三鐵磁球分散在體積比為1∶4～1∶6的乙醇和水的混合溶液中，逐滴加入0.3～0.5mL的3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯機械攪拌1～2天，得到聚合物包裹的磁球；

第三、將步驟二中得的聚合物包裹的磁球分散在40～50mL的乙腈中，加入200μL的烯丙基氯單體和300～350μL二甲基丙烯酸乙二醇酯的交聯劑及10～15mg偶氮二異丁腈引發劑于90～100℃進行回流反應，得到以具有以四氧化三鐵為核，雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的磁球；

第四、將步驟三中得的雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的磁球分散在40～50mL的1∶1～1∶5的三氯甲烷與三乙胺的混合溶液中，加入200～300mg的亞氨基乙二酸于70～90℃進行回流反應，得到以亞氨基乙二酸進行結構修飾的磁球；

第五、將步驟四中得到的亞氨基乙二酸進行結構修飾的磁球加入含有0.05～2mol/L的可溶性銅、鎳、鈦及其他重金屬離子的溶液中，用氫氧化鈉溶液將溶液pH值調整為6～9，在室溫下實現金屬離子的固定化，得到螯合金屬離子的磁性微球。

一種特異性多肽或者蛋白的富集檢測方法，其具體步驟為：

(1)將制得的螯合金屬離子的磁球用水溶液進行清洗1～3次，去除游離的金屬離子；

(2)將步驟(1)清洗后的螯合金屬離子的磁球與0.4～0.6mg/L蛋白溶液例如牛血清白蛋白(BSA)和牛血紅蛋白(BHb)進行混合1～2h，利用磁分離對含有組氨酸的多肽或者蛋白進行選擇性富集和快速分離，實現對高豐度的多肽或蛋白進行去除和低豐度的多肽或蛋白的富集；

(3)將步驟(2)中吸附多肽或蛋白的磁球用0.2～0.4g/mL的咪唑溶液進行洗脫，用于檢測或其他應用目的；

(4)可以利用紫外光譜進行檢測，并計算磁球對特異性多肽或蛋白的吸附容量。

與現有技術相比，本發明的積極效果是：