[發(fā)明專利]表達(dá)海腎或螢火蟲熒光素酶基因的PRRSV重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法以及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510069182.2
• 申請(qǐng)日: 2015-02-10
• 公開（公告）號(hào): CN104694561B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高飛;童光志;周艷君;姜一峰;曲澤惠;李麗薇;虞凌雪;鄭浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/66
• 分類號(hào): C12N15/66;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

背景技術(shù)：

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種病毒的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法和應(yīng)用，更具體地說，涉及到能夠表達(dá)海腎和螢火蟲熒光素酶的豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建與其在指征PRRSV復(fù)制水平上的應(yīng)用。

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是一種嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的接觸性傳染病，給世界各國(guó)造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。其病原PRRSV一直處于不斷的變異及進(jìn)化過程中。目前，反向遺傳操作被廣泛應(yīng)用于研究PRRSV的生物學(xué)特性、致病機(jī)理、毒力決定因子以及不斷變異的分子機(jī)制，而其基因組作為外源基因表達(dá)載體的研究也被廣泛開展。PRRSV的基因組中除ORF1和ORF2以及ORF4和ORF5外，其結(jié)構(gòu)蛋白編碼框架之間有少則幾個(gè)多則逾百的堿基重疊(overlap)。相關(guān)研究表明：ORF重疊區(qū)的影響會(huì)導(dǎo)致嵌合病毒失去感染性，因此可選擇非重疊區(qū)或者將重疊區(qū)拉開作為外源基因的插入位點(diǎn)。需要注意的是外源基因的插入原則應(yīng)以能在最小程度上改變病毒基因組為基礎(chǔ)。但即便如此，插入外源基因也會(huì)在傳代過程中逐漸丟失編碼序列以致無法發(fā)揮其功能。呈現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定性。Dr.DongwanYoo 2009年報(bào)道了其在ORF1b和ORF2之間插入了GFP基因，如果在其3′端下游插入一個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的(由其自身及周圍序列形成)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列6(TRS6)的拷貝，讓外源基因的表達(dá)被一個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄子所引導(dǎo)。所構(gòu)建的突變體克隆能夠在至少37代次的傳達(dá)過程中保遺傳穩(wěn)定。Dr.Chengbao Wang的研究則表明TRS6拷貝的插入同樣能夠使在其他位點(diǎn)插入的外源序列穩(wěn)定。而Dr.Dongwan Yoo在構(gòu)建時(shí)在外源基因插入點(diǎn)的5′端和3′端分別引入了兩個(gè)外源的酶切位點(diǎn)Afl II和Mlu I，以方便下游的替換或者插入操作，但是這或多或少可能對(duì)親本病毒的生物學(xué)特性造成影響。Dr.Chengbao Wang所依賴的反向遺傳操作系統(tǒng)是細(xì)菌人工染色體，而其外源基因的插入位點(diǎn)在ORF7和3′UTR之間。這個(gè)位點(diǎn)并沒有編碼基因的重疊，另外ORF7編碼的是PRRSV病毒表達(dá)量最大的核衣殼蛋白(N protein)，因此這里也是外源基因插入的一個(gè)很好的選擇。而他們同樣選取了TRS6作為外源基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。在TRS6的引導(dǎo)下，GFP這個(gè)外源基因仍然得到了很好的穩(wěn)定的表達(dá)。

熒光素酶(英文名稱：Luciferase)是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是一種學(xué)名為Photinus pyrail的螢火蟲體內(nèi)的熒光素酶。在相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)中，熒光的產(chǎn)生是來自于熒光素的氧化，有些情況下反應(yīng)系統(tǒng)中也包括三磷酸腺苷(ATP)。螢火蟲發(fā)出的淡黃綠色的光是由其體內(nèi)的熒光素酶產(chǎn)生的，這并不是一個(gè)簡(jiǎn)單的過程，早在很久以前，人們就已經(jīng)通過對(duì)細(xì)菌、真菌、海葵及螢火蟲的研究，發(fā)現(xiàn)了生物的發(fā)光現(xiàn)象。熒光素酶的輔因子，即熒光素，能與氧結(jié)合形成一個(gè)高度緊張的復(fù)合物，當(dāng)這個(gè)氧化物在ATP的參與下被破壞時(shí)，產(chǎn)生CO2，從而形成具有較高活性的形式，即可發(fā)光。與O2結(jié)合的是熒光素酶中的熒光素，222酶蛋白種類多樣，決定了熒光素也有不同的大小和形狀。對(duì)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)熒光素或熒光素酶不是特定的分子，而是對(duì)于所有能夠產(chǎn)生熒光的底物和其對(duì)應(yīng)的酶的統(tǒng)稱，雖然它們各不相同，不同的能夠控制發(fā)光的生物體用不用的熒光素酶來催化不同的發(fā)光反應(yīng)，最為人所知的發(fā)光生物是螢火蟲，另外目前應(yīng)用比較廣泛的海腎熒光素酶的生物體海腎。在本發(fā)明中，所插入的海腎熒光素酶基因來源于pGMR-TK，其編碼基因?yàn)?36bp，螢火蟲熒光素酶基因來源于pGL3-Basic，編碼基因長(zhǎng)度為1653bp。

在本發(fā)明中，在高致病性藍(lán)耳病細(xì)胞致弱疫苗株HuN4-F112的全長(zhǎng)感染性克隆骨架的ORF1b和ORF2a之間分別插入了海腎熒光素酶基因和螢火蟲熒光素酶基因，獲得了能夠穩(wěn)定表達(dá)這兩個(gè)熒光素酶基因的重組PRRSV：pA-Rluc和pA-Flue，對(duì)其進(jìn)行一系列病毒特性分析及遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)；并在病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯水平對(duì)其與親本病毒進(jìn)行比較分析。并通過用這兩個(gè)帶有熒光素酶基因的突變病毒vA-Rluc和vA-Flue感染MARC-145和PAM之后，收取細(xì)胞裂解物對(duì)其進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)的方法對(duì)病毒在細(xì)胞上的復(fù)制水平進(jìn)行比較分析，對(duì)其作為指征病毒復(fù)制水平的一種指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于，提供表達(dá)海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶基因的PRRSV重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。