[發明專利]表達海腎或螢火蟲熒光素酶基因的PRRSV重組質粒的構建方法以及應用

有效

• 申請號: 201510069182.2
• 申請日: 2015-02-10
• 公開（公告）號: CN104694561B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 高飛;童光志;周艷君;姜一峰;曲澤惠;李麗薇;虞凌雪;鄭浩
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種表達海腎或螢火蟲熒光素酶基因的PRRSV重組質粒，所述重組質粒為pA-Rluc和pA-Fluc，其制備方法為利用SOE PCR制備嵌合重組質粒，所述方法具體為：根據pGMR-TK海腎熒光素酶報告基因載體和pGL3-Basic螢火蟲熒光素報告基因載體中的兩個熒光素酶基因序列以及高致病性藍耳病細胞致弱疫苗株HuN4-F112的基因序列設計SOE PCR引物，在HuN4-F112的ORF1b和ORF2之前分別插入Renilla和Firefly Luciferase基因，并在外源基因3′端下游插入此病毒的轉錄調控序列6，將擴增出的兩個嵌合片段通過Asc I和EcoR V雙酶切，然后回收PCR產物連接到HuN4-F112的Asc I和EcoR V雙酶切載體上，從而獲得了兩個嵌合重組質粒pA-Rluc和pA-Fluc；所述方法中使用的引物為：

HF11559：5′-TCATACATCCGAGTTCCTGTT′-3′(SEQ ID NO.1)

HR13090：5′-GAAATATTGTCATGGCGAGGC-3′(SEQ ID NO.2)

RLUC-F2：5′-TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAATGACTTCGAAAGTTTATGATCCAG-3′(SEQ ID NO.3)

RLUC-R1：5′-TTTGTTCTGGATCATAAACTTTCGAAGTCATTTCAATTCAGGCCTAAAG-3′(SEQ ID NO.4)

RLUC-F4：5′-CAAATCGTTCGTTGAGCGAGTTCTCAAAAATGAACAATAAGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGATG-3′(SEQ ID NO.5)

RLUC-R2/R3：5′-CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACTTATTGTTCATTTTTGAGAACT-3′(SEQ ID NO.6)

FLUC-F2：5′-TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG-3′(SEQ ID NO.7)

FLUC-R1：5′-GGCCTTTCTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCATTTCAATTCAGGCCTAAAGTT-3′(SEQ ID NO.8)

FLUC-F4：5′-CTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAAGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGATG-3′(SEQ ID NO.9)

FLUC-R2/R3：5′-CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACTTACACGGCGATCTTTCCGCC-3′(SEQ ID NO.10)；

具體構建步驟如下：

1.1.1擴增SOE-1PCR產物

以pHuN4-F112作為模板，引物HF11559和Rluc-R1/Fluc-R1分別作為上游引物和下游引物，PCR擴增突變片段SOE-1；

1.1.2擴增SOE-2PCR產物

以pGMR-TK和pGL3-Basic質粒為模板，引物Rluc-F2/Fluc-F2和Rluc-R2/R3/Fluc-R2/R3分別作為上游引物和下游引物，PCR擴增SOE-2；

1.1.3擴增SOE-4PCR產物

以pHuN4-F112作為模板，以Rluc-F4/Fluc-F4和HR13090上下游引物對10μM，PCR擴增SOE-4；

1.1.4擴增SOE-3PCR產物

以SOE-1和SOE-2PCR回收產物作為模板，以HF11559和Rluc-R2/R3/Fluc-R2/R3上下游引物對PCR擴增SOE-3；

1.1.5擴增SOE-5PCR產物

以SOE-3和SOE-4PCR回收產物作為模板，以HF11559和HR13090上下游引物對10μM，PCR擴增SOE-5；

1.2表達海腎熒光素酶或熒光蟲熒光素酶重組PRRSV質粒的構建

將上述SOE-5的PCR產物使用Asc I/EcoR V進行雙酶切，再與經過Asc I和EcoR V雙酶切的親本病毒全長質粒pHuN4-F112的大片段通過T4 DNA連接酶連按，經測序鑒定后篩選出陽性克隆，獲得pA-Rluc(SEQ ID NO.11)和pA-Fluc(SEQ ID NO.12)。