[發明專利]基于納米金模擬過氧化物酶的脲酶及其抑制劑的測定方法

有效

• 申請號: 201510069027.0
• 申請日: 2015-02-10
• 公開（公告）號: CN104634779B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 陳偉;鄧豪華;沈奕珉;李光文;劉愛林
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/31;G01N1/28
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司35208
• 代理人: 王義星

1.一種基于納米金模擬過氧化物酶的脲酶測定方法，其特征是將0.05 mL不同濃度的脲酶溶液和尿素溶液加入到0.5 mL濃度為10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸緩沖液中，搖勻后37°C溫浴30分鐘，反應結束后，加入0.2 mL 質量分數為30%的過氧化氫溶液、0.05 mL濃度為16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽溶液和0.10 mL納米金溶液，混合均勻后37°C溫浴10分鐘，立即加入0.2 mL 體積分數為20%的硫酸溶液終止反應，測定吸光度值A₄₅₀，在1.8 ~ 90 U/L濃度范圍內，A₄₅₀與脲酶濃度呈線性關系，檢測限為1.8 U/L；所使用的納米金采用檸檬酸三鈉還原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加熱煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的檸檬酸三鈉溶液，反應溶液由從淺黃色變成酒紅色，繼續回流15分鐘后，將反應溶液慢慢冷卻至室溫，所得的納米金粒徑為13 nm，濃度為3.1 nmoL/L，4 °C保存。

2.根據權利要求1所述的基于納米金模擬過氧化物酶的脲酶測定方法，其特征是所使用的尿素溶液的體積為0.1 mL，濃度為0.5 moL/L。

3.一種基于納米金模擬過氧化物酶測定土壤中脲酶的方法，包括如下步驟：取5g直徑< 2 mm的干燥土壤樣品，加入9 mL濃度為10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸緩沖溶液和0.2 mL甲苯，充分混勻后，置于6000轉/分鐘離心20分鐘，取上清液進行超濾純化，得樣品溶液，將0.05 mL樣品溶液和0.1 mL 0.5 moL/L尿素溶液加入到0.5 mL濃度為10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸緩沖液中，搖勻后37°C溫浴30分鐘，反應結束后，加入0.2 mL 質量分數為30%的過氧化氫溶液、0.05 mL濃度為16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽溶液和0.10 mL的納米金溶液，混合均勻后37°C溫浴10分鐘，立即加入0.2 mL 體積分數為20%的硫酸溶液終止反應，測定吸光度值A₄₅₀，通過吸光度值標準曲線進行定量，獲得土壤樣品中脲酶的含量。

4.根據權利要求3所述的基于納米金模擬過氧化物酶測定土壤中脲酶的方法，其特征是所使用的納米金采用檸檬酸三鈉還原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加熱煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的檸檬酸三鈉溶液，反應溶液由從淺黃色變成酒紅色，繼續回流15分鐘后，將反應溶液慢慢冷卻至室溫，所得的納米金粒徑為13 nm，濃度為3.1 nmoL/L，4 °C保存。

5.一種基于納米金模擬過氧化物酶的脲酶抑制劑測定方法，其特征是將脲酶溶液和0.1 mL 5 mmoL/L尿素溶液加入到0.5 mL含不同濃度乙酰氧肟酸的濃度為10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸緩沖液中，搖勻后37°C溫浴30分鐘，反應結束后，加入0.2 mL質量分數為 30%的過氧化氫溶液、0.05 mL濃度為16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽溶液和0.10 mL納米金溶液，混合均勻后37°C溫浴10分鐘，立即加入0.2 mL 體積分數為20%的硫酸溶液終止反應，測定吸光度值A₄₅₀，計算抑制率，通過軟件擬合得到乙酰氧肟酸的IC₅₀為0.05 mmoL/L；所使用的納米金采用檸檬酸三鈉還原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加熱煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的檸檬酸三鈉溶液，反應溶液由從淺黃色變成酒紅色，繼續回流15分鐘后，將反應溶液慢慢冷卻至室溫，所得的納米金粒徑為13 nm，濃度為3.1 nmoL/L，4 °C保存。

6.根據權利要求5所述的基于納米金模擬過氧化物酶的脲酶抑制劑測定方法，其特征是所使用的脲酶溶液的體積為0.05 mL，濃度為18 U/L。