[發明專利]基于納米金模擬過氧化物酶的脲酶及其抑制劑的測定方法

有效

• 申請號: 201510069027.0
• 申請日: 2015-02-10
• 公開（公告）號: CN104634779B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 陳偉;鄧豪華;沈奕珉;李光文;劉愛林
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/31;G01N1/28
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司35208
• 代理人: 王義星

技術領域

本發明涉及基于納米金模擬過氧化物酶催化顯色體系的脲酶及其抑制劑的測定方法，屬于分析化學和納米技術領域。

背景技術

脲酶（urease）是一種含鎳的寡聚酶，它能高效、特異性催化尿素水解生成二氧化碳和氨。醫學上，細菌脲酶是一種不容忽視的致病因素，它可誘發許多疾病，如腎盂腎炎、肝昏迷、消化性潰瘍和感染性尿路結石等。脲酶抑制劑作為一種藥物可溶解尿結石，阻止尿液生成新的晶體。農業上，當土壤脲酶的活性過高時，化肥中的尿素被迅速分解生成氨，排放到大氣中，造成經濟損失及環境污染。為了減少環境污染和提高化肥中尿素氮的利用率，脲酶抑制劑的使用是一個極佳的選擇。由上可知，脲酶及其抑制劑的檢測具有十分重要的意義。

隨著納米技術的發展，許多種類的納米材料，例如，金屬納米材料、氧化物納米材料、半導體納米材料和導電納米聚合物等已經廣泛被應用于化學及生物傳感器領域。在所有的納米材料中，金納米粒子（Gold nanoparticles, GNPs）由于其易于制備和生物功能化、優良的生物穩定性和獨特的光譜特性最受到研究者們的關注。基于納米金的色度傳感器近年來得到了廣泛關注，其中的大部分均是基于納米金聚集或聚集再分散過程中的等離子體耦合而產生的顏色變化。納米金已越來越多地應用于比色法檢測細胞、蛋白質、DNA、金屬離子和小分子等。

本發明利用納米金模擬過氧化物酶-過氧化氫-3,3',5,5'-四甲基聯苯胺鹽酸鹽催化顯色體系與脲酶催化尿素水解反應體系耦合，構建了一種簡便、靈敏的脲酶及其抑制劑的檢測新方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于納米金模擬過氧化物酶-過氧化氫-3,3',5,5'-四甲基聯苯胺鹽酸鹽催化顯色體系的脲酶及其抑制劑的測定方法。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：本發明所述的基于納米金模擬過氧化物酶的脲酶及其抑制劑的測定方法，其特征是利用脲酶催化尿素水解反應體系耦合納米金模擬過氧化物酶-過氧化氫-3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽催化顯色反應體系，結合溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，直接用于脲酶及其抑制劑含量的測定。

上述所使用的納米金采用檸檬酸三鈉還原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加熱煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的檸檬酸三鈉溶液，反應溶液由從淺黃色變成酒紅色，繼續回流15分鐘后，將反應溶液慢慢冷卻至室溫，所得的納米金粒徑為13 nm，濃度為3.1 nmoL/L，4 °C保存。

本發明所述的基于納米金模擬過氧化物酶的脲酶測定方法，其特征是將0.05 mL不同濃度的脲酶溶液和尿素溶液加入到0.5 mL濃度為10 mmoL/L，pH=6.40的磷酸緩沖液中，搖勻后37°C溫浴30分鐘，反應結束后，加入0.2 mL 質量分數為30%的過氧化氫溶液、0.05 mL濃度為16 mmoL/L的3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽溶液和0.10 mL納米金溶液，混合均勻后37°C溫浴10分鐘，立即加入0.2 mL 體積分數為20%的硫酸溶液終止反應，測定吸光度值A₄₅₀，在1.8 ~ 90 U/L濃度范圍內，A₄₅₀與脲酶濃度呈線性關系，檢測限為1.8 U/L；所使用的納米金采用檸檬酸三鈉還原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加熱煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的檸檬酸三鈉溶液，反應溶液由從淺黃色變成酒紅色，繼續回流15分鐘后，將反應溶液慢慢冷卻至室溫，所得的納米金粒徑為13 nm，濃度為3.1 nmoL/L，4 °C保存。

所使用的尿素溶液的體積為0.1 mL，濃度為0.5 moL/L。