[發明專利]同時測定血漿中脂蛋白磷脂酶A2和C反應蛋白的層析法快速檢測卡及試劑盒

在審

• 申請號: 201510067870.5
• 申請日: 2015-02-09
• 公開（公告）號: CN104614534A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發明（設計）人: 楊子學
• 申請（專利權）人: 楊子學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/573
• 代理公司: 北京天平專利商標代理有限公司 11239
• 代理人: 繆友菊

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種采用層析法同時測定血漿中脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)與C反應蛋白(CRP)含量的檢測試劑盒，從而對缺血性腦卒中的分型、病情或預后評估進行輔助診斷的試劑盒。

背景技術

缺血性腦卒中是腦血管病中最常見者，其常見的病因為動脈粥樣硬化導致管腔狹窄和腦血栓形成，造成局部腦供血區血流中斷，發生腦組織缺血、缺氧、軟化壞死。大量研究表明動脈粥樣硬化本身是一個炎癥的過程，持續的低水平炎癥預示著心腦血管疾病發生的可能性。Lp-PLA2為新近發現的炎癥標志物，屬于磷脂酶A2超家族中的非鈣離子依賴型磷酸酯酶，主要由炎癥細胞(如巨噬細胞、淋巴細胞等)分泌，并受炎癥介質的調節。CRP是由肝臟合成的一種全身性炎癥反應急性期的非特異性標志物，是心腦血管疾病最強有力的預測因子之一，對心血管、腦血管以及外周血管疾病有著最好的預測及預后效果。

有研究表明，Lp-PLA2與CRP水平都升高者患缺血性腦卒中的風險最高，其水平隨神經功能缺損程度增加而呈遞增趨勢，差異有統計學意義。高水平的Lp-PLA2、CRP對預測腦梗死風險有重要意義。盡管Lp-PLA2、CRP都是炎癥形成的標志物，但它們在體內作用的機制不同，Lp-PLA2主要與脂類的代謝，特別是LDL代謝相關。CRP與炎癥及血栓形成都存在密切的關系，標明炎癥和血栓形成的交互關系。

目前對缺血性腦卒中的診斷與預測尚未出現將Lp-PLA2與CRP兩個指標進行聯合的檢測方法，且對其單指標檢測的方法主要有酶聯免疫法和免疫比濁法，而這兩種方法的前處理過程較為復雜，大規模推廣存在局限性。

在免疫分析領域缺乏能夠同時檢測Lp-PLA2和CRP的技術及其應用。因此，在實踐中有必要建立一種敏感度高、操作簡單、成本低、適合大規模推廣的檢測方法。

發明內容

發明目的：針對現有技術不足，本發明提供一種同時測定血漿中Lp-PLA2和CRP的層析法快速檢測卡，其可以解決現有技術存在的不能在一個試紙條中同時檢測Lp-PLA2和CRP的問題。

技術方案：為實現上述技術目的，本發明提出了一種同時測定血漿中Lp-PLA2和CRP的層析法快速檢測卡，包括底襯以及從左到右順次相互搭接粘貼在底襯上方的樣品墊、涂覆有膠乳微球標記抗體的試劑墊、包被膜和吸水紙，所述包被膜上在靠近吸水紙的一端劃有一條包被了兔抗鼠IgG單克隆抗體的質控線，所述包被膜上在靠近試劑墊的一端劃有兩條平行的第一檢測線和第二檢測線，其中，靠近試劑墊的第一檢測線上包被有能與待檢抗原Lp-PLA2特異性結合的單克隆抗體，第二檢測線上包被有能與待檢抗原CRP特異結合的單克隆抗體。包被膜上在靠近試劑墊的一端劃有兩條平行的檢測線。其中，靠近試劑墊的第一檢測線上包被有能與待檢抗原Lp-PLA2特異性結合的單克隆抗體，另一條檢測線(第二檢測線)上包被有能與待檢抗原CRP特異結合的單克隆抗體。所述的待檢抗原Lp-PLA2是人Lp-PLA2，所述待檢抗原CRP是人CRP。

優選地，所述的底襯為PVC底板或其他硬質不吸水的材料；所述樣品墊為吸濾紙或濾油紙；所述試劑墊可為聚酯膜；包被膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。

本發明同時提出了上述層析法快速檢測卡的制備方法，包括如下步驟：

1)包被膜的制備：用包被緩沖液分別稀釋能與待檢抗原Lp-PLA2特異性結合的抗體、能與待檢抗原CRP特異結合的抗體和兔抗鼠IgG抗體，并將稀釋后的三種抗體分別平行地噴于包被膜上對應的第一檢測線、第二檢測線和控制線，待三種抗體滲入包被膜后分別形成第一檢測線、第二檢測線和控制線；

2)噴涂有膠乳顆粒標記抗體的聚酯膜(試劑墊)的制備：分別制備連接了Lp-PLA2特異性抗體的膠乳顆粒與連接了CRP特異性抗體的膠乳顆粒，這兩種顆粒可以具有相同或者不同的顏色，利用這兩種膠乳顆粒的混合物噴涂聚酯膜；

3)組裝試紙條：在試紙條底襯上順次相互搭接粘貼樣品墊、噴涂有膠乳顆粒標記抗體的聚酯膜、包被膜及吸水紙。

其中，所述抗體與膠乳顆粒連接可通過如下方法實現：物理吸附法和化學偶聯法，其中，物理吸附法主要適用于膠體金標記抗體；化學偶聯法主要適用于彩色膠乳顆粒標記抗體包括碳二亞胺縮合法、過碘酸鹽氧化法及重氮鹽偶聯法等。