[發(fā)明專利]用于乙型肝炎病毒感染治療的導(dǎo)向RNA靶點(diǎn)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510067097.2
• 申請(qǐng)日: 2015-02-09
• 公開（公告）號(hào): CN104711257B
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魯鳳民;王杰;許中偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 魯鳳民;王杰;許中偉
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12N15/63;A61K48/00;A61P31/20
• 代理公司: 北京奉思知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11464
• 代理人: 吳立,鄒軼鮫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和基因治療領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染治療的15個(gè)導(dǎo)向RNA(short guide RNA，gRNA)靶點(diǎn)，通過這些靶點(diǎn)獲得的導(dǎo)向RNA及其重組表達(dá)載體，以及應(yīng)用這些靶點(diǎn)和導(dǎo)向RNA以各種方式獲得的用于HBV感染治療的藥物和方法。

背景技術(shù)

目前針對(duì)HBV的抗病毒藥物為核苷酸類似物和干擾素。雖然，核苷酸類似物(Nucleotide，NAs)可通過抑制HBV聚合酶的活性高效抑制HBV復(fù)制，但其對(duì)HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circular DNA，cccDNA)無(wú)作用，由于cccDNA是HBV復(fù)制的模版，其半衰期可達(dá)數(shù)年至數(shù)十年，所以短期內(nèi)NAs不能清除HBV，機(jī)體免疫力低下或耐藥等因素均可誘發(fā)HBV再激活和肝炎復(fù)發(fā)。盡管，干擾素α(IFN-α)可清除一部分感染者體內(nèi)的HBV，且體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)高劑量的IFN-α可降解cccDNA，但其清除比例較低(＜8％)，且由于高劑量的IFN-α具有很強(qiáng)的副作用，機(jī)體不能耐受。因此，HBV cccDNA是慢性乙型肝炎(乙肝)治療過程中的一大障礙，目前尚無(wú)高效清除HBV cccDNA的方法。

CRISPR/Cas系統(tǒng)，是最近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的可對(duì)基因組DNA進(jìn)行靶向編輯的工具。該系統(tǒng)原本是存在于細(xì)菌中的一種對(duì)付病毒等外來(lái)DNA的防御系統(tǒng)。在一些細(xì)菌基因組中存在一系列成簇排列的DNA序列，被稱作“規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列”(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)。這些重復(fù)序列的間隔序列，被發(fā)現(xiàn)和很多能夠侵入細(xì)菌的噬菌體DNA序列相同。并且，這些序列在被轉(zhuǎn)錄成為RNA后，能夠與宿主細(xì)菌產(chǎn)生的一類稱為Cas(CRISPR associated)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，來(lái)對(duì)Cas蛋白起到導(dǎo)向作用，因此這段RNA也被稱為導(dǎo)向RNA(guide RNA，gRNA)。當(dāng)復(fù)合體檢測(cè)到入侵的DNA和gRNA序列一致時(shí)，CRISPR/Cas系統(tǒng)可以識(shí)別外源核酸中的特殊片段，該特殊片段中含有原型間隔序列毗鄰基序(即Protospacer Associated Motif，PAM)。Cas蛋白由此到達(dá)PAM識(shí)別序列的特定位點(diǎn)而對(duì)外來(lái)DNA進(jìn)行定點(diǎn)、特異的切割，達(dá)到DNA序列的修飾或者編輯的目的。

嚴(yán)格來(lái)說，在細(xì)菌體內(nèi)gRNA由兩部分組成：一部分為來(lái)自于間隔區(qū)、識(shí)別入侵DNA的crRNA(CRISPR RNA，crRNA)，另一部分為活化Cas蛋白所需的tracrRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)。在人工構(gòu)建的CRISPR-Cas9系統(tǒng)載體中，這兩段RNA可融合為一條，稱為導(dǎo)向RNA(guide RNA，gRNA)。

細(xì)菌中的CRISPR-Cas系統(tǒng)極為多樣，而一個(gè)來(lái)自產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的由Cas9蛋白參與的系統(tǒng)被人們研究的最為透徹。因此人們對(duì)它進(jìn)行了改造，將編碼Cas9蛋白的序列及其附屬元件共同制造成為一個(gè)單一的載體。在轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后，產(chǎn)生的人工構(gòu)建的gRNA就能指導(dǎo)Cas9蛋白切割宿主細(xì)胞特定的DNA序列，從而起到基因編輯的作用。

以CRISPR-Cas系統(tǒng)為基礎(chǔ)將有望開發(fā)出新型的更有效地用于HBV感染治療的方法，該方法需要提供有效清除HBV cccDNA的gRNA靶點(diǎn)。本發(fā)明滿足了這一要求，提供了用于該目的的gRNA靶點(diǎn)、gRNA和重組表達(dá)載體等。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上問題，本發(fā)明提供了靶向HBV的gRNA靶點(diǎn)，用于構(gòu)建包含或互補(bǔ)本發(fā)明涉及的gRNA靶點(diǎn)的表達(dá)載體、重組載體和宿主細(xì)胞，以及可獲得用于獲得包含有由本發(fā)明涉及的gRNA靶點(diǎn)獲得的治療藥物。

本發(fā)明提供的gRNA靶點(diǎn)可靶向HBV，可破壞共價(jià)閉合環(huán)狀DNA并抑制HBV復(fù)制。本發(fā)明提供的gRNA靶點(diǎn)是通過以下方法獲得的：選擇設(shè)計(jì)可靶向HBV的gRNA靶點(diǎn)序列，通過設(shè)計(jì)合適的引物構(gòu)建gRNA，并克隆入表達(dá)載體獲得相應(yīng)的gRNA表達(dá)載體，將該載體分別與HBV表達(dá)載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，通過檢測(cè)HBV表面抗原水平及鑒定抑制特異性等分析篩選獲得合適的gRNA靶點(diǎn)。

本發(fā)明提供一種靶向HBV的導(dǎo)向RNA靶點(diǎn)序列，其選自以下序列之一：

(1)SEQ ID NOs：1-15中任一個(gè)所述的序列；