[發(fā)明專利]提供流感病毒異源保護(hù)的病毒樣顆粒及其方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510066914.2
• 申請(qǐng)日: 2015-02-07
• 公開（公告）號(hào): CN104726416B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏咸柱;任志廣;高玉偉;冀顯亮;孟令楠;鄭學(xué)星;王化磊;魏玉榮;王鐵成;馮娜;楊松濤;趙永坤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N7/04
• 分類號(hào): C12N7/04;C12N15/866;C12N15/44;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 北京中譽(yù)威圣知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11279
• 代理人: 李紅偉;孟祥斌

一種提供流感病毒異源保護(hù)的病毒樣顆粒及其方法和應(yīng)用，由依據(jù)昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子優(yōu)化后的H5N1流感NA?HA?M1基因與經(jīng)酶切的pFastBac1載體連接，制得重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞得到重組桿狀病毒，用該病毒接種昆蟲細(xì)胞后，表達(dá)得到所述病毒樣顆粒，其中，優(yōu)化后的H5N1流感NA?HA?M1基因序列如SEQ ID NO.1所示。具有生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量高，免疫原性高，安全性好，便于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，小鼠實(shí)驗(yàn)證明H5N1流感病毒樣顆粒能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，對(duì)現(xiàn)在主要流行的H5N1 2.3.2.1和2.3.4譜系的流感病毒具有很好的免疫和預(yù)防效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，微生物領(lǐng)域及生物制藥領(lǐng)域，特別涉及一種提供流感病毒異源保護(hù)的病毒樣顆粒及其方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

A型流感病毒病毒感染能夠引起呼吸道疾病對(duì)人類健康和世界經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重影響，1997年第一次報(bào)道人感染高致病性H5N1(HPAI)流感病毒感染，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道截止到2014年1月9號(hào)全球共報(bào)道649人感染病例，并引起385人死亡，從2003年開始高致病性H5N1成為主要的人獸共患病之一并且不斷的衍生出新的譜系，高致病H5N1主要在中國(guó)，越南，印度尼西亞，埃及，哥倫比亞和孟加拉國(guó)等地流行，其中2.3.2.1和2.3.4譜系成為主要的流行譜系，但是現(xiàn)在也很難預(yù)測(cè)不同的H5N1譜系中哪個(gè)會(huì)造成大規(guī)模的流行，因此現(xiàn)在急需發(fā)明一種疫苗能夠交叉保護(hù)不同H5N1譜系的病毒。

現(xiàn)在主要通過(guò)雞胚進(jìn)行流感疫苗的大量生產(chǎn)，但是在流感大流行季節(jié)這種生產(chǎn)方式很難滿足流感疫苗的大量生產(chǎn)，并且常常需要花費(fèi)數(shù)月的時(shí)間來(lái)確定新的流感流行譜系，更重要的是最近在亞洲流行的H5N1流感病毒能夠造出雞胚的死亡。然而基于重組桿狀病毒生產(chǎn)的流感病毒樣顆粒能夠解決H5N1流感疫苗生產(chǎn)中的問(wèn)題，因此病毒樣顆粒成為一種無(wú)生物安全風(fēng)險(xiǎn)，低成本，和高產(chǎn)出的流感疫苗生產(chǎn)方 式。流感病毒樣顆粒具有和天然病毒相似的HA結(jié)構(gòu)，因?yàn)槠銱A結(jié)構(gòu)避免了常規(guī)滅活疫苗生產(chǎn)中的化學(xué)物質(zhì)的破壞，從而能夠產(chǎn)生更好的免疫保護(hù)作用。

目前流感病毒樣顆粒包括由流感HA、NA和流感基質(zhì)蛋白M1或者HA和M1在小鼠實(shí)驗(yàn)中能夠產(chǎn)生真對(duì)流感高滴度的特異性抗體，這些顆粒能夠展示出很好的針對(duì)異源流感病毒的保護(hù)活性，但是還沒有文獻(xiàn)報(bào)道與滅活的全病毒疫苗相比流感病毒真對(duì)不同H5N1譜系的保護(hù)活性。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種提供流感病毒異源保護(hù)的病毒樣顆粒及其方法和應(yīng)用。本發(fā)明利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)包含流感NA-HA-M1的H5N1流感病毒樣顆粒，并且在小鼠體內(nèi)研究在弗式佐劑時(shí)與滅活的流感疫苗相比針對(duì)不同譜系的流感的病毒的保護(hù)活性。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種提供流感病毒異源保護(hù)的病毒樣顆粒，由依據(jù)昆蟲細(xì)胞偏愛密碼子優(yōu)化后的H5N1流感NA-HA-M1基因與經(jīng)酶切的pFastBac1載體連接，制得重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞得到重組桿狀病毒，用該病毒接種昆蟲細(xì)胞后，表達(dá)得到所述病毒樣顆粒，其中，優(yōu)化后的H5N1流感NA-HA-M1基因序列如SEQ ID NO.1所示。

進(jìn)一步的，所述優(yōu)化后的H5N1流感NA-HA-M1基因與pFastBac1載體酶切的限制性內(nèi)切酶為Not I和Sph I。

進(jìn)一步的，所述優(yōu)化遵循：編碼的氨基酸序列不變；將稀有密碼子去除；將影響mRNA穩(wěn)定性和核糖體結(jié)合的莖環(huán)結(jié)構(gòu)破壞。

進(jìn)一步的，所述病毒樣顆粒的純化方式為，在4℃離心機(jī)中用2,000rpm離心20min去掉細(xì)胞碎片，用30,000rpm離心60分鐘進(jìn)行濃縮，用PBS溶解沉淀過(guò)夜后經(jīng)20％-30％-60％的蔗糖30,000rpm離心1小時(shí)進(jìn)行純化。

上述提供流感病毒異源保護(hù)的病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟：