[發明專利]提供流感病毒異源保護的病毒樣顆粒及其方法和應用

有效

• 申請號: 201510066914.2
• 申請日: 2015-02-07
• 公開（公告）號: CN104726416B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 夏咸柱;任志廣;高玉偉;冀顯亮;孟令楠;鄭學星;王化磊;魏玉榮;王鐵成;馮娜;楊松濤;趙永坤
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N15/866;C12N15/44;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 李紅偉;孟祥斌

1.一種提供流感病毒異源保護的病毒樣顆粒，其特征在于，由依據昆蟲細胞偏愛密碼子優化后的H5N1流感NA-HA-M1基因與經酶切的pFastBac1載體連接，制得重組桿狀病毒Bacmid質粒，并轉染昆蟲細胞得到重組桿狀病毒，用該病毒接種昆蟲細胞后，表達得到所述病毒樣顆粒，其中，優化后的H5N1流感NA-HA-M1基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的病毒樣顆粒，其特征在于，所述優化后的H5N1流感NA-HA-M1基因與pFastBac1載體酶切的限制性內切酶為Not I 和Sph I。

3.權利要求1或2所述的病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、重組桿狀病毒Bacmid質粒的構建：將優化的NA-HA-M1基因和pFastBac1載體的基因進行多克隆位點分析，選擇載體上提供而目的片段中沒有的兩個限制性內切酶：NotI和Sph I，雙酶切后回收目的片段插入到昆蟲細胞表達載體pFastBac1中，轉化大腸桿菌DH10Bac感受態細胞；

步驟二、重組桿狀病毒的拯救：用重組桿狀病毒Bacmid質粒轉染昆蟲細胞，拯救獲得重組桿狀病毒；

步驟三、高致病性H5N1流感病毒樣顆粒的制備：將獲得的重組桿狀病毒按MOI＝3接種昆蟲細胞，3天后收獲上清，即得高致病性H5N1流感病毒樣顆粒。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟一中，具體操作為：取1μlpFastBac-NA-HA-M1加入到50μl感受態DH10Bac細胞中，冰浴30min，42℃熱激45s，冰浴2min，加入1ml無抗性的LB培養基，37℃培養48h，挑取白斑菌落，加入LB培養基，37℃200rpm/min搖床培養12h，提取質粒DNA進行PCR鑒定，鑒定正確的陽性質粒即為重組桿狀病毒Bacmid質粒。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟二、三中使用的昆蟲細胞為Sf9細胞。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟二中待Sf9細胞的細胞匯合達到80％以上時方進行轉染。

7.提供流感病毒異源保護的病毒樣顆粒在制備用于預防流感方面的特異性疫苗方面的應用，其特征在于，所述病毒樣顆粒是權利要求1或2所述的病毒樣顆粒。