[發明專利]一株金屬硫蛋白細胞表面展示酵母及其在重金屬吸附中的應用

在審

• 申請號: 201510066856.3
• 申請日: 2015-02-06
• 公開（公告）號: CN104774865A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 陳麗杰;湯曉燕;袁文杰;秦配玲
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/31;C12N1/19;B01J20/24;C12R1/865
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生;李馨

技術領域

本發明涉及基因工程技術和環境工程重金屬污染治理領域，具體涉及能夠使金屬硫蛋白在細胞表面表達的整合載體和該載體的構建方法、以及轉化該整合載體得到的能夠在細胞表面表達金屬硫蛋白的轉基因酵母和該酵母在制備重金屬生物吸附材料中的應用。

背景技術

來自工業廢物的重金屬對環境的污染，已經成為當今世界重要的環境問題之一。重金屬污染物主要來源于電鍍業、冶金業、采礦業等，重金屬污染物不可以通過化學或者生物處理被降解成無毒物質，其不僅可以永久存在于環境中，而且重金屬可以在食物鏈中積累。環境和廢水中重金屬的去除成為社會關注的重要問題之一。

目前除去水溶液中的重金屬的方法主要有物理、化學和生物技術。重金屬處理的具體方法主要有化學沉淀、過濾、離子交換、電化學催化、膜技術、活性炭吸附、蒸發等，但是這些方法通常比較昂貴并且效率比較低，尤其是在重金屬濃度比較低(1–100mg/L)時，而生物吸附方法與其他方法相比操作簡單、高效快速、可以將重金屬從ppt水平減少到ppb水平。故重金屬生物吸附法是目前有效解決重金屬污染的方法之一，國內外對生物吸附法在重金屬吸附領域的應用做了大量的研究工作，其中，由于金屬硫蛋白可對重金屬特異性結合而被應用于重金屬吸附的研究。

金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸、低分子量(3500-14000Da)、可被金屬誘導表達的蛋白質，金屬硫蛋白的半胱氨酸殘基上的巰基可以結合生理重金屬(如Zn²⁺、Cu²⁺)和外源重金屬(如Cd²⁺、Hg²⁺、Ag²⁺、As³⁺)，金屬硫蛋白中的巰基含量占氨基酸殘基的30％。有許多研究表明，金屬硫蛋白在細胞內可以提高微生物對重金屬Cu²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Cr³⁺、Cr⁶⁺、As³⁺等的耐性和吸附能力。而金屬硫蛋白在細胞表面表達時，其可以避免金屬離子的跨膜問題，金屬硫蛋白可在細胞外直接結合金屬離子，這不僅可以提高吸附速率，而且可以降低金屬離子對細胞的損傷。Kuroda等^[1]將酵母金屬硫蛋白通過α-凝集素細胞表面展示系統表達?在釀酒酵母的細胞表面，隨后Cd²⁺的吸附率提高至27.10nmol/mg細胞干重，但該展示系統不能整合在酵母染色體上，釀酒酵母只有在篩選培養基中金屬硫蛋白才能表達在細胞表面，Kuroda文中所使用的釀酒酵母是營養缺陷型的不易實現工業化應用，并且Kuroda文中的重組菌株對Cd²⁺和Cu²⁺等金屬離子的吸附力也較低。目前還沒有在細胞表面展示金屬硫蛋白的能夠對多種重金屬離子如Cd²⁺、Cu²⁺、Cr等均具有高效吸附重金屬離子能力的工業酵母細胞。Kuroda等^[1]構建的重組菌株只對Cd²⁺吸附能力有提高，但是對Cu²⁺和Cr都沒有明顯的效果。

參考文獻：?

[1]Kuroda?K,et?al.Applied?Microbiology?and?Biotechnology,2003,63(2):182-186.?

發明內容

本發明的目的在于提供一株能夠在細胞表面展示金屬硫蛋白的以有效的提高酵母細胞對重金屬吸附能力的重組酵母，該重組酵母是通過能夠使金屬硫蛋白在細胞表面表達的整合載體，將金屬硫蛋白細胞表面展示盒子基因和組成型啟動子P_PGK1基因整合到宿主菌染色體上而獲得的。

本發明是采用如下技術方案來實現的：

本發明的第一方面，提供一種能夠使金屬硫蛋白在細胞表面表達的整合載體，該整合載體是通過SEQ?ID?NO.2所示的金屬硫蛋白細胞表面展示盒子基因和SEQ?ID?NO.3所示的組成型啟動子P_PGK1基因插入到載體pHO-2上而獲得的。

其中所述金屬硫蛋白細胞表面展示盒子基因包括a–凝集素(AGA2)基因和金屬硫蛋白基因(cup1)。

本發明的第二方面，提供所述的整合載體的構建方法，包括如下步驟：

(1)采用PCR擴增反應從釀酒酵母S.cerevisiae?288c的基因組DNA中克隆出cup1基因，如SEQ?ID?NO.1所示；其中PCR擴增反應的引物序列為：