[發明專利]一株金屬硫蛋白細胞表面展示酵母及其在重金屬吸附中的應用在審
| 申請號： | 201510066856.3 | 申請日： | 2015-02-06 |
| 公開（公告）號： | CN104774865A | 公開（公告）日： | 2015-07-15 |
| 發明（設計）人： | 陳麗杰;湯曉燕;袁文杰;秦配玲 | 申請（專利權）人： | 大連理工大學 |
| 主分類號： | C12N15/81 | 分類號： | C12N15/81;C12N15/31;C12N1/19;B01J20/24;C12R1/865 |
| 代理公司： | 大連東方專利代理有限責任公司 21212 | 代理人： | 賈漢生;李馨 |
| 地址： | 116024 遼*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 金屬 蛋白 細胞 表面 展示 酵母 及其 重金屬 吸附 中的 應用 | ||
1.一種能夠使金屬硫蛋白在細胞表面表達的整合載體，其特征在于，該整合載體是通過SEQ?ID?NO.2所示的金屬硫蛋白細胞表面展示盒子基因和SEQ?ID?NO.3所示的組成型啟動子PPGK1基因插入到載體pHO-2上而獲得的。
2.權利要求1所述的整合載體的構建方法，包括如下步驟：
(1)采用PCR擴增反應從釀酒酵母S.cerevisiae?288c的基因組DNA中克隆出cup1基因，如SEQ?ID?NO.1所示；其中PCR擴增反應的引物序列為：
cup1-F：CCGGAATTCATGTTCAGCGAATTAATTA?
cup1-R：CCGCTCGAGGTCGATTAAACTTCCTTC?
(2)將cup1插入到游離載體pYD1的EcoR?Ⅰ和Xho?I兩限制性內切酶位點之間，獲得重組載體pYD1/cup1；
(3)采用PCR擴增反應從重組載體pYD1/cup1中克隆出金屬硫蛋白細胞表面展示盒子基因AGA2/cup1，如SEQ?ID?NO.2所示；其中PCR擴增反應的引物序列為：
AGA2-cup1-F：GCGGTCGACGCTGTAATACGACTCACT
AGA2-cup1-R：AGACCCGGGACTTGCCCAATTCTCTTA
(4)將步驟(3)的金屬硫蛋白細胞表面展示盒子基因插入到載體pHO-2的Sal?I和Sma?I兩限制性內切酶位點之間，得到重組載體HAC；
(5)采用PCR擴增反應從釀酒酵母S.cerevisiae?288c的基因組DNA中克隆出組成型啟動子PPGK1基因，如SEQ?ID?NO.3所示，并將其插入到重組載體HAC的BsiW?I和Sal?I兩限制性內切酶位點之間，得到整合載體HACg；其中PCR擴增反應的引物序列為：
PPGK1-F：GCACGTACGACTGTAATTGCTTTTAGTTG
PPGK1-R：TACGTCGACTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAG?。
3.在細胞表面展示金屬硫蛋白的具有高效吸附重金屬離子功能的重組菌株，其特征在于，該重組菌是通過權利要求1所述的整合載體，將SEQ?ID?NO.2所示的基因和SEQ?ID?NO.3所示的基因整合到宿主菌染色體上而獲得的。
4.根據權利要求3所述的重組菌株，其特征在于，所述的宿主菌為工業釀酒酵母S.cerevisiae?4126。
5.權利要求3或4所述的重組菌株在制備重金屬生物吸附材料中的應用。
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