[發(fā)明專利]一種將hpalXoo基因轉(zhuǎn)入短短芽孢桿菌HAB-5的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510065645.8
• 申請(qǐng)日: 2015-02-09
• 公開（公告）號(hào): CN104762326A
• 公開（公告）日: 2015-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 繆衛(wèi)國;汪惠;劉文波;政服叢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 海南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/87
• 分類號(hào): C12N15/87;C12N15/31;C12R1/01
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 徐慶蓮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種將hpa1_Xoo基因轉(zhuǎn)入短短芽孢桿菌HAB-5的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

定向的改造野生型菌株，使之適合不同環(huán)境、不同靶標(biāo)的生物防治，無疑具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。因此近年來，人們開始熱衷于利用分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的手段進(jìn)行生防菌的遺傳改良，改善它們對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)性、擴(kuò)大應(yīng)用范圍。芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中研究較成熟的菌株是枯草芽孢桿菌，但是由于其胞外蛋白酶活性很強(qiáng)，會(huì)大量降解外源蛋白，所以在構(gòu)建工程生防菌株時(shí)造成較大的局限性；蘇云金芽孢桿菌雖然胞外蛋白酶活性不高，但是野生菌株中含有大量的內(nèi)生質(zhì)粒，而這些內(nèi)生質(zhì)粒對(duì)外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)帶來較大的影響；短芽孢桿菌和短短芽孢桿菌則只有枯草芽孢桿菌的1.6%胞外蛋白酶活性（Udaka?etal.?1993）并且細(xì)胞壁較薄，內(nèi)生質(zhì)粒較少，所以成了生防菌株和外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建中宿主細(xì)胞的重要選擇。

目前外源基因?qū)胨拗骶闹饕侄斡懈惺軕B(tài)法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法雖然有較高的轉(zhuǎn)化率，但由于短芽孢桿菌細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)（由外蛋白層和內(nèi)肽聚糖層組成），去掉細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體再生非常困難，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法不能運(yùn)用于短芽孢桿菌（UDAKA?S.etal?1989）。其中，電擊轉(zhuǎn)化法被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化效率最高的一種方法。然而，電擊轉(zhuǎn)化過程中需要平衡轉(zhuǎn)化效率和死亡率的關(guān)系，隨著電場強(qiáng)度的增加，外源?DNA?進(jìn)入宿主細(xì)胞的可能性越大，死亡率也隨之增加。陸雁等以不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化復(fù)制子轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB600中，最高轉(zhuǎn)化率為2.58×10⁴?cfu/ug；王培培等對(duì)枯草芽孢桿菌NCD電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，最高效率為6.07×10⁴?cfu/ug；而目前芽孢桿菌電擊轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率最高為1.4×10⁶?cfu/ug，還不能滿足高效率轉(zhuǎn)化，如構(gòu)建基因文庫的要求。且電擊轉(zhuǎn)化法對(duì)試驗(yàn)技能有較高的要求,電場強(qiáng)度是電擊轉(zhuǎn)化中最敏感的參數(shù),直接影響轉(zhuǎn)化效率;外加電場引起細(xì)胞部分原生質(zhì)化,在沒有特殊再生條件的情況下,部分轉(zhuǎn)化子將會(huì)死亡,降低了轉(zhuǎn)化子獲得率。李瑞芳等（2011）比較了電擊轉(zhuǎn)化法和本研究所使用的化學(xué)轉(zhuǎn)化法對(duì)枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)電擊轉(zhuǎn)化法對(duì)細(xì)胞分泌表達(dá)的損傷大于化學(xué)轉(zhuǎn)化法。

（彭清忠等?2004）也嘗試用適用于各種細(xì)菌轉(zhuǎn)化的TSS?法轉(zhuǎn)化5?株短芽孢桿菌,?但都未成功。由此看來,?此方法并不是對(duì)每種細(xì)菌都適用。短芽孢桿菌由于其特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以及各菌株之間的結(jié)構(gòu)差異,?找到一種通用的有效轉(zhuǎn)化方法還存在一定困難。Tris-PEG?方法是一種新的轉(zhuǎn)化短芽孢桿菌的方法。Udaka?等利用此方法轉(zhuǎn)化具有雙層細(xì)胞壁蛋白的短芽孢桿菌47?時(shí)非常成功，最佳條件下轉(zhuǎn)化率高達(dá)10⁵~?10⁶?個(gè)轉(zhuǎn)化子/?ug?DNA。但在轉(zhuǎn)化僅有1?層細(xì)胞壁蛋白層的短芽孢桿菌HPD31?時(shí)獲得非常低的轉(zhuǎn)化率或沒有轉(zhuǎn)化子獲得。彭清忠等也利用此方法嘗試對(duì)5?株野生短芽孢桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)，僅50?號(hào)和735?號(hào)菌獲得成功，且轉(zhuǎn)化效率非常低(?最高轉(zhuǎn)化率102?個(gè)轉(zhuǎn)化子/?ugDNA)。總體看來，Tris-?PEG?轉(zhuǎn)化方法并不適合于所有的短芽孢桿菌,?而且由于菌株的不同，?轉(zhuǎn)化效率有很大的區(qū)別。周海燕等（2008）采用Tris-PEG將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至短短芽孢桿菌且其酶活力顯著提高。所以這些例子都為功能基因的研究奠定了基礎(chǔ)。

HAB-5是一株從棉花根際土壤分離出來的拮抗細(xì)菌，經(jīng)16SrRNA?初步鑒定為短短芽孢桿菌(Brevibacillus?brevs)?,研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)多株植物病原真菌具有強(qiáng)烈的抑制作用,且在促進(jìn)植株生長，防治植物病害方面也有一定的作用。

hpa1_Xoo?是來自水稻白葉枯病菌（X.?oryzae?pv.?oryzae）菌株JXOⅢ的hrp基因簇中的hpa（harpin-associated）基因，編碼harpinXoo蛋白。這種蛋白具有Harpin的特征，且可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種有益表型。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出一種將基因hpa1_Xoo轉(zhuǎn)入短短芽孢桿菌HAB-5的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，操作簡便，重復(fù)性好，轉(zhuǎn)化率高。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種短短芽孢桿菌HAB-5的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：