[發明專利]一種將hpalXoo基因轉入短短芽孢桿菌HAB-5的化學轉化方法

在審

• 申請號: 201510065645.8
• 申請日: 2015-02-09
• 公開（公告）號: CN104762326A
• 公開（公告）日: 2015-07-08
• 發明（設計）人: 繆衛國;汪惠;劉文波;政服叢
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N15/31;C12R1/01
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 徐慶蓮

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是指一種將hpa1_Xoo基因轉入短短芽孢桿菌HAB-5的化學轉化方法。

背景技術

定向的改造野生型菌株，使之適合不同環境、不同靶標的生物防治，無疑具有重要的理論和現實意義。因此近年來，人們開始熱衷于利用分子生物學及分子遺傳學的手段進行生防菌的遺傳改良，改善它們對環境條件的適應性、擴大應用范圍。芽孢桿菌表達系統中研究較成熟的菌株是枯草芽孢桿菌，但是由于其胞外蛋白酶活性很強，會大量降解外源蛋白，所以在構建工程生防菌株時造成較大的局限性；蘇云金芽孢桿菌雖然胞外蛋白酶活性不高，但是野生菌株中含有大量的內生質粒，而這些內生質粒對外源基因的導入和表達帶來較大的影響；短芽孢桿菌和短短芽孢桿菌則只有枯草芽孢桿菌的1.6%胞外蛋白酶活性（Udaka?etal.?1993）并且細胞壁較薄，內生質粒較少，所以成了生防菌株和外源蛋白表達系統構建中宿主細胞的重要選擇。

目前外源基因導入宿主菌的主要手段有感受態法、原生質體轉化法和電擊轉化法。原生質體轉化法雖然有較高的轉化率，但由于短芽孢桿菌細胞壁的特殊結構（由外蛋白層和內肽聚糖層組成），去掉細胞壁后的原生質體再生非常困難，原生質體轉化法不能運用于短芽孢桿菌（UDAKA?S.etal?1989）。其中，電擊轉化法被認為是轉化效率最高的一種方法。然而，電擊轉化過程中需要平衡轉化效率和死亡率的關系，隨著電場強度的增加，外源?DNA?進入宿主細胞的可能性越大，死亡率也隨之增加。陸雁等以不同預培養時間優化復制子轉化至枯草芽孢桿菌WB600中，最高轉化率為2.58×10⁴?cfu/ug；王培培等對枯草芽孢桿菌NCD電轉化條件進行優化，最高效率為6.07×10⁴?cfu/ug；而目前芽孢桿菌電擊轉化的轉化效率最高為1.4×10⁶?cfu/ug，還不能滿足高效率轉化，如構建基因文庫的要求。且電擊轉化法對試驗技能有較高的要求,電場強度是電擊轉化中最敏感的參數,直接影響轉化效率;外加電場引起細胞部分原生質化,在沒有特殊再生條件的情況下,部分轉化子將會死亡,降低了轉化子獲得率。李瑞芳等（2011）比較了電擊轉化法和本研究所使用的化學轉化法對枯草芽孢桿菌分泌表達的影響,發現電擊轉化法對細胞分泌表達的損傷大于化學轉化法。

（彭清忠等?2004）也嘗試用適用于各種細菌轉化的TSS?法轉化5?株短芽孢桿菌,?但都未成功。由此看來,?此方法并不是對每種細菌都適用。短芽孢桿菌由于其特殊的細胞壁結構以及各菌株之間的結構差異,?找到一種通用的有效轉化方法還存在一定困難。Tris-PEG?方法是一種新的轉化短芽孢桿菌的方法。Udaka?等利用此方法轉化具有雙層細胞壁蛋白的短芽孢桿菌47?時非常成功，最佳條件下轉化率高達10⁵~?10⁶?個轉化子/?ug?DNA。但在轉化僅有1?層細胞壁蛋白層的短芽孢桿菌HPD31?時獲得非常低的轉化率或沒有轉化子獲得。彭清忠等也利用此方法嘗試對5?株野生短芽孢桿菌進行轉，僅50?號和735?號菌獲得成功，且轉化效率非常低(?最高轉化率102?個轉化子/?ugDNA)。總體看來，Tris-?PEG?轉化方法并不適合于所有的短芽孢桿菌,?而且由于菌株的不同，?轉化效率有很大的區別。周海燕等（2008）采用Tris-PEG將重組質粒轉化至短短芽孢桿菌且其酶活力顯著提高。所以這些例子都為功能基因的研究奠定了基礎。

HAB-5是一株從棉花根際土壤分離出來的拮抗細菌，經16SrRNA?初步鑒定為短短芽孢桿菌(Brevibacillus?brevs)?,研究發現其對多株植物病原真菌具有強烈的抑制作用,且在促進植株生長，防治植物病害方面也有一定的作用。

hpa1_Xoo?是來自水稻白葉枯病菌（X.?oryzae?pv.?oryzae）菌株JXOⅢ的hrp基因簇中的hpa（harpin-associated）基因，編碼harpinXoo蛋白。這種蛋白具有Harpin的特征，且可誘導植物產生多種有益表型。

發明內容

本發明提出一種將基因hpa1_Xoo轉入短短芽孢桿菌HAB-5的化學轉化方法，操作簡便，重復性好，轉化率高。

本發明的技術方案是這樣實現的：

一種短短芽孢桿菌HAB-5的化學轉化方法，包括以下步驟：