[發明專利]一種長白仔豬睪丸支持細胞永生系的建立方法

有效

• 申請號: 201510065430.6
• 申請日: 2015-02-06
• 公開（公告）號: CN104673742B
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發明（設計）人: 張守全;白銀山;馮美瑩;衛恒習;李莉
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種長白仔睪丸支持細胞永生系建立用培養液及使用培養液建立長白仔睪丸支持細胞永生系的方法和應用。

背景技術

睪丸支持細胞(sertoli cells，SCs)是位于睪丸組織生精小管內部一類具有強大分泌功能的細胞。它對生精細胞起到了支持和營養作用，有效的保證生精細胞的自我更新和精子發生的有序進行。

睪丸SCs不僅是構成生精細胞的支架，而且可以將血液中的各類營養物質間接地傳送給各級生精細胞。同時自身也能分泌轉鐵蛋白、胰島素樣生長因子、成纖維生長因子、膠質神經營養因子、干細胞分化因子、雄激素結合蛋白、硫酸糖蛋白1和2、轉化生長因子α和β、白介素-1α和6等多種細胞因子，實現了生精細胞的自我更新和精子發生的有序進行。其中雄激素結合蛋白可以和雄激素相結合，在局部形成高濃度的雄激素環境時精子成熟的關鍵環節。

SCs在睪丸組織內還構成了血睪屏障，也參與免疫調控。不僅有效的防止生精細胞自身抗原與機體接觸而引發的免疫反應。同時自身高表達FASL蛋白，可與激活后的T淋巴細胞上的FAS結合，促使T淋巴細胞凋亡，因此產生了睪丸組織的免疫豁免現象。

SCs不僅可以支持自體精原干細胞的增殖和分化，而且可以支持同種和異種的精原干細胞增殖和分化，還可促進睪丸外其他組織細胞的自我更新和分化。具有廣泛的應用前景，但研究認為成熟的SCs是終末細胞，不能分裂。

豬源的睪丸傳代細胞系(ST細胞系)，是早期通過傳代方法建立的豬睪丸SCs的細胞系，不表達Large T和Egfp，適用于一些病毒的復制，已較多地應用于多種動物病毒學研究及疫苗生產中。所以能穩定表達Large T和Egfp的長白仔豬SCs建立對于豬業生產相關的試驗研究也具有重要意義和潛在應用的前景。

發明內容

基于此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種長白仔睪丸支持細胞永生系建立用的培養液、以及用該培養液建立長白仔睪丸支持細胞永生系的方法。

為了實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案：

一種長白仔睪丸支持細胞永生系建立用的培養液，所述培養液為：添加了12～18％FBS，50～60μMβ-巰基乙醇，0.8～1.2％ITS，0.8～1.2％L-谷氨酰胺，0.8～1.2％核苷酸，45～55μg/mL維生素C和0.8～1.2％雙抗的DMEM培養基。所述核苷酸為幾種核苷酸的混合物。

在其中一個實施例中，所述培養液為：添加了15％FBS，55μMβ-巰基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，50μg/mL維生素C和含1％雙抗的DMEM培養基。

本發明還提供了一種長白仔睪丸支持細胞永生系的建立方法，包括以下步驟：

1)、取長白仔豬睪丸組織，通過機械法和酶消化法獲取高比例的長白仔豬睪丸支持細胞以后，完全培養基培養1～2h后更換新鮮培養液，繼續培養，傳代至獲得細胞形態均一的F3代的睪丸成纖維細胞；

2)、利用攜帶Large T和Egfp基因的慢病毒液侵染F3代的睪丸成纖維細胞，進行細胞篩選，傳代至得到穩定表達Egfp的細胞株；

3)將穩定表達Egfp的細胞株，進行單細胞篩選，篩選出表達睪丸支持細胞標記的細胞株，使用上述培養液傳代50代以上，經細胞生物學分析檢測，獲得長白仔睪丸支持細胞永生系。

在其中一個實施例中，步驟2)中所述傳代的代數為9代。

在其中一個實施例中，步驟3)中所述細胞生物學檢測為生長曲線分析、特異性基因分析、細胞核型分析、特異性蛋白分析、致瘤性分析和ST細胞系對比。

本發明還提供了上述建立方法建立的長白仔睪丸支持細胞永生系。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：