[發(fā)明專利]一種長白仔豬睪丸支持細胞永生系的建立方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201510065430.6 | 申請日： | 2015-02-06 |
| 公開（公告）號： | CN104673742B | 公開（公告）日： | 2017-12-29 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張守全;白銀山;馮美瑩;衛(wèi)恒習(xí);李莉 | 申請（專利權(quán)）人： | 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11246 | 代理人： | 龔燮英 |
| 地址： | 510642 廣東省廣州市天*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 仔豬 睪丸 支持 細胞 永生 建立 方法 | ||
1.一種長白仔睪丸支持細胞永生系建立用的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液為：添加了12～18％FBS，50～60μMβ-巰基乙醇，0.8～1.2％ITS，0.8～1.2％L-谷氨酰胺，0.8～1.2％核苷酸，45～55μg/mL維生素C和0.8～1.2％雙抗的DMEM培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長白仔睪丸支持細胞永生系建立用的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液為：添加了15％FBS，55μMβ-巰基乙醇，1％ITS，1％L-谷氨酰胺，1％核苷酸，50μg/mL維生素C和1％雙抗的DMEM培養(yǎng)基。
3.一種長白仔睪丸支持細胞永生系的建立方法，其特征在于，包括以下步驟：
1)、取長白仔豬睪丸組織，機械法和酶消化法獲取高比例的長白仔豬睪丸支持細胞以后，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1～2h后更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，傳代至獲得細胞形態(tài)均一的F3代的睪丸成纖維細胞；
2)、利用攜帶Large T和Egfp基因的慢病毒液侵染F3代的睪丸成纖維細胞，進行細胞篩選，傳代至得到穩(wěn)定表達Egfp的細胞株；
3)將穩(wěn)定表達Egfp的細胞株進行單細胞篩選，篩選出表達睪丸支持細胞標記的細胞株，使用權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)液傳代50代以上，經(jīng)細胞生物學(xué)分析檢測，獲得長白仔睪丸支持細胞永生系。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的長白仔睪丸支持細胞永生系的建立方法，其特征在于，步驟2)中所述傳代的代數(shù)為9代。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的長白仔睪丸支持細胞永生系的建立方法，其特征在于，步驟3)中所述細胞生物學(xué)檢測為生長曲線分析、特異性基因分析、細胞核型分析、特異性蛋白分析、致瘤性分析和ST細胞系對比。
6.權(quán)利要求1～5任一項所述的建立方法建立的長白仔睪丸支持細胞永生系。
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