[發明專利]一種牛臍帶間充質干細胞的分離及培養方法

有效

• 申請號: 201510064168.3
• 申請日: 2015-02-06
• 公開（公告）號: CN104630142B
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 葛嘯虎;陳海佳;王一飛;陳潔鴻;羅二梅
• 申請（專利權）人: 廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 廣州圣理華知識產權代理有限公司 44302
• 代理人: 頓海舟;陳業勝

本發明公開了一種牛臍帶間充質干細胞的分離及培養方法，包括:獲取胎牛臍帶，組織塊貼壁法分離細胞；當細胞爬出后，完全培養基培養；當細胞融合度達到80％～90％后，消化1～3min，終止消化、吹打，獲得牛臍帶間充質干細胞；所述完全培養基為添加了EGF和PDGF的無血清培養基，其中EGF的濃度為5～10ng/mL，PDGF的濃度為5～10ng/mL。本發明采用組織塊貼壁法對牛臍帶MSC進行了原代分離，在無血清培養基中加入了EGF及PDGF進行培養擴增，成功得到了具有自我更新及分化潛能的牛臍帶MSC。在培養體系中添加了EGF及PDGF，不僅促進了該細胞的體外擴增，并抑制了該細胞在體外培養的分化。

技術領域

本發明屬于生命科學領域，具體涉及一種牛臍帶間充質干細胞的分離及培養方法。

背景技術

間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層。MSC具有干細胞的共性，即自我更新、多向分化和歸巢的能力。在特定的機體外分化環境下，能夠誘導分化為神經、心臟、肝臟、骨、軟骨、肌腱、脂肪、上皮等多種組織細胞。

MSC由于具有自我更新和多向分化的潛能，成為了近年來研究的熱點。大量研究證實，MSC可以從骨髓分離得到，但也存在于其他不同組織和臟器，如肌肉、脂肪組織、臍血、臍帶、胎盤、血管等。

臍帶是哺乳類具有的連接胎兒和胎盤的管狀結構,由兩條動脈、一條靜脈以及包裹于它們表面的膠凍狀組織-華通氏膠(Wharton's jelly)所組成。2003年Romanov等從臍靜脈內皮、臍帶華通氏膠和血管周圍組織中分離獲得了MSCs。臍帶來源的MSC經過原代培養后形成的成纖維細胞，它們的形態、表面標記及其分化潛能與骨髓間充質干細胞(BM-MSC)相似。

來源于臍帶的MSC，由于屬于胚胎外組織，是胎兒分娩后的廢棄物，來源廣泛、獲得成功率高、含量高、增殖能力強、免疫原性低、生物性能穩定、無社會倫理道德限制等優點。

目前針對牛臍帶MSC的分離方法尚未建立，現有技術中對于人臍帶MSC研究得較多，主要的分離方法是酶消化法跟組織塊貼壁法。酶消化法分離臍帶間充質干細胞的方法存在一些缺點，酶消化的過程需要消耗一定的時間，延長了分離的時間；而且使用胰酶或膠原酶消化臍帶，也大大增加了分離過程的成本；再次，酶消化法過程較為繁瑣，且在分離的效果上穩定性較差。組織塊貼壁法雖然在獲得原代細胞的時間上比較長，但是其操作上比較簡單，成本也比較低，因此更加適合推廣與應用。另外，分離所得到的原代細胞一般數量較少，需在體外進行傳代擴增，現有技術中常見的培養體系就是采用DMEM/F12培養基加上體積比為10％的胎牛血清(FBS)進行臍帶MSC的體外培養與擴增。

發明內容

本發明技術以牛臍帶為組織材料，采用了操作較為簡便的組織塊貼壁法對牛臍帶進行了MSC的原代分離，并對其進行了擴增培養，成功分離得到了牛臍帶MSC。擴增培養體系在無血清培養基(廠家：Lonza，商品名：通用Ultra CULTURE無血清培養基)，并添加了表皮細胞生長因子(EGF，濃度范圍5～10ng/mL)以及血小板衍生因子(PDGF，濃度范圍5～10ng/mL)，促進了牛臍帶MSC的高效擴增。

現有技術中酶消化法分離臍帶MSC的方法存在一些缺點，酶消化過程延長了分離的時間；而且使用胰酶或膠原酶消化臍帶，也大大增加了分離過程的成本；再次，酶消化法過程較為繁瑣，且在分離的效果上穩定性較差。另外采用DMEM/F12培養基加上體積比為10％的胎牛血清(FBS)的培養體系，細胞生長必須依賴于胎牛血清，培養的細胞分化或衰老得較快。

本發明目的通過以下技術方案來實現。

一種牛臍帶間充質干細胞的分離及培養方法，包括以下步驟:

(1)獲取胎牛臍帶，獲得牛臍帶組織塊，剪碎，將完全培養基加到組織塊中，吹打均勻后轉移到細胞培養皿中；