[發(fā)明專利]一種牛臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510064168.3
• 申請(qǐng)日: 2015-02-06
• 公開（公告）號(hào): CN104630142B
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛嘯虎;陳海佳;王一飛;陳潔鴻;羅二梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 廣州圣理華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44302
• 代理人: 頓海舟;陳業(yè)勝

1.一種牛臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟:

(1)獲取胎牛臍帶，獲得牛臍帶組織塊，剪碎，將完全培養(yǎng)基加到組織塊中，吹打均勻后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中；

(2)搖晃培養(yǎng)皿使組織塊均勻分布于培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并定期添加完全培養(yǎng)基；

(3)當(dāng)細(xì)胞爬出后，棄掉舊培養(yǎng)基及組織塊，用PBS清洗培養(yǎng)皿后，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(4)當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80％～90％后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS清洗培養(yǎng)皿后，加入含EDTA的胰酶混合液進(jìn)行消化1～3min，待80％～90％細(xì)胞變圓即加入完全培養(yǎng)基終止消化，并將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，獲得牛臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；

所述完全培養(yǎng)基為添加了EGF和PDGF的無(wú)血清培養(yǎng)基，其中EGF的濃度為5～10ng/mL，PDGF的濃度為5～10ng/mL；所述胰酶混合液中EDTA的濃度為0.01g/L，胰酶的濃度為0.25g/L，濃度均為質(zhì)量體積比，所述無(wú)血清培養(yǎng)基為通用Ultra CULTURE無(wú)血清培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)所述完全培養(yǎng)基的加入量是每1cm臍帶添加1ml完全培養(yǎng)基。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于，所述定期添加完全培養(yǎng)基是每隔3-5天添加一次，每次完全培養(yǎng)基的添加量為3ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述獲得牛臍帶組織是將胎牛臍帶剪成1cm的小段，用組織鑷剝掉臍帶外面的膜，再去除動(dòng)脈和靜脈，把獲得的組織剪至1mm³大小。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離及培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件是5％CO₂、37℃、飽和濕度為95％。