[發明專利]一種骨髓單核細胞提取及向破骨細胞分化的方法

在審

• 申請號: 201510063630.8
• 申請日: 2015-02-09
• 公開（公告）號: CN104651302A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 周龍;何帆;陳曦;羅宗平;楊惠林
• 申請（專利權）人: 蘇州大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 曹毅

技術領域

本發明屬于細胞提取、分化鑒定領域，涉及一種骨髓單核細胞提取及向破骨細胞分化的方法。

背景技術

近幾年人口老齡化的問題日益嚴重，老年性骨質疏松、骨質疏松性髖部骨折等老年相關性疾病發病率明顯增高。人工關節置換術是治療老年骨關節退行性疾病和老年股骨頸骨折的重要選擇，假體周圍骨溶解和假體松動是人工關節置換術后的主要遠期并發癥。如何預防或延遲它的發生是一個重要課題，它們從病理研究方面與破骨細胞有密切關系，成功獲得破骨細胞將是進一步研究其功能的關鍵。

目前破骨細胞的獲得主要有新生動物機械分離法、全骨髓誘導法、外周血/骨髓單核細胞誘導法和脾細胞誘導法。新生動物個體小，獲得細胞數量少，且破骨細胞在機械分離過程中易受損傷、壽命短；全骨髓誘導法獲得的破骨細胞純度較低；骨髓單核細胞是一種未成熟的單核細胞，被認為是破骨細胞的前體細胞，較外周血單個核細胞誘導的破骨細胞得率高、全骨髓誘導法產生的破骨細胞數量多，純度高，較脾細胞誘導法分化效率高。

骨髓單核細胞的分離提取國內外很少有文獻報道，大多是利用RAW264.7細胞誘導分化為破骨細胞。文獻中涉及到的骨髓單核細胞的分離方法可歸結為：密度梯度離心法，藥物貼壁篩選法，但均未對其純化及鑒定的方法做具體的闡述。

C57BL/6小鼠因其易于大量繁殖，基因與人類相近，能夠很容易的復制各種類似人類的疾病，因而在醫學基礎研究中地位十分重要。

因此，如何建立一種簡易的、行之有效的體外分離、純化和大量擴增骨髓單核細胞的方法，同時誘導其向破骨細胞分化在骨質疏松性疾病中的治療研究等方面顯得尤為重要。

發明內容

要解決的技術問題：骨髓單核細胞的常規提取分離、及向破骨細胞分化的方法報道較少，并且僅有的方法的純化方法和鑒定方法也并不清晰；并且至今仍未有成熟的破骨細胞株，獲取較困難，大多是采用小鼠的單核／巨噬細胞RAW264．7誘導分化獲得，但由于RAW264．7是細胞系，用于具體的實驗研究很多機理不是很明確；因此本發明的目的在于公開一種簡易、有效的骨髓單核細胞的提取及向破骨細胞分化的方法。

技術方案：本發明的骨髓單核細胞的提取及向破骨細胞分化的方法通過以下技術方案予以實現：

一種骨髓單核細胞提取及向破骨細胞分化的方法，包括以下步驟：

（A）無菌分離骨髓單核細胞，在20-100ng/mL?M-CSF的完全培養基中培養，隔天換液，觀察單核細胞的形態特征；

（B）單核細胞密度為80-90%時，取出部分細胞行表面抗原鑒定；

（C）其余細胞用于生長曲線的繪制及破骨細胞的分化誘導。

進一步的，所述的一種骨髓單核細胞提取及向破骨細胞分化的方法，

步驟（A）中觀察單核細胞的形態特征為采用倒置顯微鏡記錄單核細胞第1,3,5天的形態特征變化；

步驟（B）中表面抗原鑒定為采用流式細胞術檢測分析單核細胞表面抗原CD11b的陽性表達率；

步驟（C）中生長曲線的繪制為采用MTT法測定單核細胞第1-5天的增殖情況，繪制生長曲線，分析M-CSF對單核細胞增殖的影響；

步驟（C）中破骨細胞的分化誘導為采用M-CSF和核因子κB受體活化因子配基進行分化誘導并用TRAP染色、F-actin熒光染色鑒定破骨細胞。

進一步的，所述的一種骨髓單核細胞提取及向破骨細胞分化的方法，所述的骨髓單核細胞取自C57BL/6小鼠。

進一步的，所述的一種骨髓單核細胞提取及向破骨細胞分化的方法，所述的完全培養基組分為α-MEM?為80~90%體積比，胎牛血清10~20%體積比，抗生素10~200?U/mL。

進一步的，所述的一種骨髓單核細胞提取及向破骨細胞分化的方法，步驟（C）中分化誘導采用的M-CSF濃度為20-100ng/mL，RANKL為50-100ng/mL。

有益效果：與現有技術相比，本發明的特點為：