[發(fā)明專利]一種骨髓單核細(xì)胞提取及向破骨細(xì)胞分化的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201510063630.8
• 申請日: 2015-02-09
• 公開（公告）號(hào): CN104651302A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周龍;何帆;陳曦;羅宗平;楊惠林
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 曹毅

1.一種骨髓單核細(xì)胞提取及向破骨細(xì)胞分化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（A）無菌分離骨髓單核細(xì)胞，在20-100ng/mL?M-CSF的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隔天換液，觀察單核細(xì)胞的形態(tài)特征；

（B）單核細(xì)胞密度為80-90%時(shí)，取出部分細(xì)胞行表面抗原鑒定；

（C）其余細(xì)胞用于生長曲線的繪制及破骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種骨髓單核細(xì)胞提取及向破骨細(xì)胞分化的方法，其特征在于：

步驟（A）中觀察單核細(xì)胞的形態(tài)特征為采用倒置顯微鏡記錄單核細(xì)胞第1,3,5天的形態(tài)特征變化；

步驟（B）中表面抗原鑒定為采用流式細(xì)胞術(shù)檢測分析單核細(xì)胞表面抗原CD11b的陽性表達(dá)率；

步驟（C）中生長曲線的繪制為采用MTT法測定單核細(xì)胞第1-5天的增殖情況，繪制生長曲線，分析M-CSF對單核細(xì)胞增殖的影響；

步驟（C）中破骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo)為采用M-CSF和核因子κB受體活化因子配基進(jìn)行分化誘導(dǎo)并用TRAP染色、F-actin熒光染色鑒定破骨細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種骨髓單核細(xì)胞提取及向破骨細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所述的骨髓單核細(xì)胞取自C57BL/6小鼠。

4.?根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種骨髓單核細(xì)胞提取及向破骨細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所述的完全培養(yǎng)基組分為α-MEM?為80~90%體積比，胎牛血清10~20%體積比，抗生素10~200?U/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種骨髓單核細(xì)胞提取及向破骨細(xì)胞分化的方法，其特征在于，步驟（C）中分化誘導(dǎo)采用的M-CSF濃度為20-100ng/mL，RANKL為50-100ng/mL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種骨髓單核細(xì)胞提取及向破骨細(xì)胞分化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）骨髓單核細(xì)胞形態(tài)特征的觀察，表面抗原的鑒定及生長曲線的繪制

?????無菌條件下取出C57BL/6小鼠雙側(cè)股骨和脛骨；超凈臺(tái)中剪開干骺端，用5mL無菌注射器，抽取無血清α-MEM培養(yǎng)液反復(fù)輕柔沖洗骨髓腔4次；100um細(xì)胞過濾器過濾后1200rpm離心5分鐘，棄上清；加入10倍細(xì)胞體積的無菌1X紅細(xì)胞裂解液，吹打混勻，在冰上裂解5分鐘，1000rpm離心5分鐘，棄紅色上清以去除紅細(xì)胞；用無血清α-MEM培養(yǎng)液重懸沉淀洗滌2次；用含胎牛血清10%?體積比，抗生素100?U/mL的α-MEM培養(yǎng)液5mL重懸骨髓細(xì)胞，接種于25cm²?塑料培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO₂?培育箱靜置培養(yǎng)過夜16小時(shí)；收集上清，并用無血清α-MEM培養(yǎng)液清洗培養(yǎng)瓶3次，1200rpm離心5分鐘，用含胎牛血清10%?體積比，抗生素100?U/mL，100ng/mL?M-CSF的α-MEM培養(yǎng)液10mL重懸單核細(xì)胞后接種于100mm培養(yǎng)皿中；培養(yǎng)2天后棄上清液，并用無血清α-MEM培養(yǎng)液清洗培養(yǎng)皿2次；加入含胎牛血清10%?體積比，抗生素100?U/mL，100ng/mL的?M-CSF的α-MEM培養(yǎng)液直至細(xì)胞增殖至密度為80%-90%；

A.?單核細(xì)胞第1,3,5天的形態(tài)特征變化

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，分別于第1,3,5天用德國zeiss倒置顯微鏡記錄單核細(xì)胞的形態(tài)特征變化；

B.單核細(xì)胞表面抗原CD11b的陽性表達(dá)率

?????將生長狀態(tài)良好的原代骨髓單核細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下，計(jì)數(shù)后調(diào)成同一密度收集在2個(gè)EP管中，離心后去除培養(yǎng)基；2管分別加入1%BSA（用1%NaN3溶解）100uL冰上封閉30min，并標(biāo)記1,2,?1管為陰性對照，2管加入0.5μL大鼠抗小鼠CD11b熒光抗體，冰上靜置反應(yīng)30min；離心后加入PBS清洗一次，每管加入600μL的1%的多聚甲醛，轉(zhuǎn)移到流式管后上機(jī)檢測；

?C.單核細(xì)胞在M-CSF刺激下的生長曲線

??取對數(shù)生長期的原代骨髓單核細(xì)胞以1000/孔密度接種在96孔培養(yǎng)板中，分兩組，一組加100ng/mL的M-CSF，另一組不加M-CSF，每6孔為一組，每孔100μL；分別在接種后的第1d、2d、3d、4d、5d、以MTT法測細(xì)胞活力，其中加入M-CSF組每天換一次液；吸掉原培養(yǎng)液后每孔加入含有10%MTT溶液（5g/L）的培養(yǎng)液100uL繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液；每孔加入100μL?DMSO溶液，振蕩，鏡下觀察結(jié)晶物充分溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔在570nm波長處的光吸收值，每組取6孔測定值的平均值;以天數(shù)為橫軸，OD值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線；

（2）骨髓單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的鑒定

?????取對數(shù)生長期的原代骨髓單核細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下后以1×10⁴cm²密度傳代于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)(37?℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO₂)培養(yǎng)4-6天，對照組和誘導(dǎo)組各3孔，其中對照組加入20ng/mL的M-CSF，誘導(dǎo)組加入20ng/mL的M-CSF和100ng/mL的RANKL，每2天換一次液；

???破骨誘導(dǎo)培養(yǎng)4-6天，鏡下觀察到明顯的多核融合的破骨細(xì)胞時(shí)行TARP染色，細(xì)胞用4%的多聚甲醛室溫固定20分鐘，在以萘酚AS-BI磷酸鹽作為底物的孵育液中37℃孵育30min，去離子水清洗1次，DAPI染色液復(fù)染3?min，再用去離子水清洗3次，Olympus?IX71倒置顯微鏡下拍照；

破骨誘導(dǎo)培養(yǎng)4-6天，鏡下觀察到明顯的多核融合的破骨細(xì)胞時(shí)行F-actin熒光染色，細(xì)胞4%多聚甲醛冰上固定10?min，PBS清洗細(xì)胞2次后，0.25%Triton（PBS稀釋）室溫孵育10min，PBS清洗2次，加入FITC-Phalloidin工作液(5?mg/L，1%的BSA稀釋)室溫避光孵育60min，PBS清洗3次，Olympus?IX71倒置顯微鏡下觀察拍照。