[發(fā)明專利]抗稻瘟病基因Pi9的特異性CAPS標(biāo)記Pi9caps及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510062377.4
• 申請日: 2015-02-05
• 公開（公告）號: CN104630364A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱立煌;呂啟明;黃志遠(yuǎn);盤毅;唐麗;李曉兵;周壯志;辛業(yè)蕓;趙炳然;符習(xí)勤
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所;湖南雜交水稻研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;陳曉慶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗稻瘟病基因Pi9的特異性CAPS標(biāo)記Pi9caps及其應(yīng)用，屬于農(nóng)作物分子遺傳育種學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米為主食。稻瘟病是影響水稻產(chǎn)量的主要病害，位居真菌病害之首，全球每年因稻瘟病造成的水稻減產(chǎn)達(dá)10％～30％，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)達(dá)40％～50％，甚至顆粒無收。實(shí)踐證明，利用抗稻瘟病基因是控制稻瘟病害最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的方法。到目前為止，在水稻中已至少報(bào)道了68個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)共83個(gè)主效基因，這些基因成簇地分布于除第3染色體外的所有水稻染色體上，已經(jīng)克隆的有24個(gè)，它們分別是Pib,Pi-ta,Pi9,Piz-t,Pi2,Pid2,Pi36,Pi37,Rbr2,Pik-m,Pi5,Pid3,pi21,Pit,Pb1,Pish,Pik-p,Pik,Pia,Pi54,Pi25,Pi?1,Pi50,Pi54rh(國家水稻數(shù)據(jù)庫中心http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm)。然而，盡管已經(jīng)克隆的抗稻瘟病基因數(shù)量眾多，但真正具有廣譜抗性的卻很少，在這些已克隆的抗稻瘟病基因中，來源于小粒野生稻的Pi9被多個(gè)研究組證實(shí)對收集自世界各地的稻瘟病菌均具有廣譜抗性(Qu?et.al.,2006；張國民等，2010；)，因此在水稻抗稻瘟病育種中，將Pi9基因?qū)氲剿竟歉捎H本材料中就顯得尤為必要。

酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(Cleaved?Amplified?Polymorphism?Sequences，CAPS)CAPS技術(shù)又稱為PCR—RFLP，它實(shí)質(zhì)上是PCR技術(shù)與限制性片段長度多態(tài)性(Restriction?Fragment?Length?Polymorphism，RFLP)技術(shù)結(jié)合的一種方法。CAPS的基本原理是利用己知位點(diǎn)的DNA序列資源設(shè)計(jì)出一套特異性的PCR引物(19-27bp)，然后用這些引物擴(kuò)增該位點(diǎn)上的某一DNA片段，接著用一種專一性的限制性內(nèi)切酶切割所得擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠電泳分離酶切片段，染色并進(jìn)行RFLP分析。CAPS標(biāo)記揭示的是特異PCR片段的限制性長度變異的信息。CAPS是一類共顯性分子標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)是避免了RFLP分析中膜轉(zhuǎn)印這一步驟，又能保持RFLP分析的精確度。另外，由于很多限制性內(nèi)切酶均可參與擴(kuò)增DNA酶切，所以檢測到多態(tài)性機(jī)會(huì)較大。

利用常規(guī)田間表型鑒定對抗稻瘟病基因的選擇存在很大困難，選擇效率很低，選擇準(zhǔn)確性很差，而利用抗稻瘟病基因連鎖的分子標(biāo)記或者是基因本身特異性標(biāo)記選擇，在生產(chǎn)上已經(jīng)被證實(shí)是十分有效且經(jīng)濟(jì)的。針對Pi9基因的分子標(biāo)記選擇，研究者已經(jīng)開發(fā)了一些標(biāo)記，但它們都存在一些應(yīng)用上的問題或者不便，如位于Pi9基因側(cè)翼的此類分子標(biāo)記由于和Pi9基因存在一定物理距離，在減數(shù)分裂過程中存在與Pi9基因發(fā)生交換的可能，從而使選擇不夠準(zhǔn)確；針對Pi9基因本身的特異性分子標(biāo)記目前有兩例報(bào)道，一例是針對Pi9啟動(dòng)子區(qū)域的10bp插入/缺失位點(diǎn)(陳松彪等，2013)，另外一例是針對Pi9編碼區(qū)18bp酶切片段差異的dCAPS標(biāo)記(華麗霞等，2013)，但由于這兩種標(biāo)記差異的片段較小，通常需要非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳才能區(qū)分，因此在操作過程中有一些繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是更準(zhǔn)確、快速的鑒定抗稻瘟病基因Pi9進(jìn)而篩選以抗稻瘟病植株為親本的后代植株。

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種鑒定或輔助鑒定水稻是否含有抗稻瘟病基因Pi9和/或是否具有稻瘟病抗性的方法，包括如下步驟：檢測待測水稻第6號染色體中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸，根據(jù)水稻第6號染色體中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸的種類進(jìn)行鑒定：如果待測水稻第6號染色體中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸含T，則待測水稻為含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻或候選為含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻和/或具有稻瘟病抗性的水稻，如果待測水稻第6號染色體中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸不含T，則待測水稻為不含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻或候選為不含有抗稻瘟病基因Pi9的水稻。

上述方法中，所述待測水稻第6號染色體中75-1-127BAC12.1序列或其同源序列自5’末端起第40804位核苷酸含T具體可為A’或B’：