[發(fā)明專利]一種缺失sfp基因的生防菌及其發(fā)酵工藝和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510061973.0
• 申請(qǐng)日: 2015-02-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104673716B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 繆衛(wèi)國(guó);靳鵬飛;劉文波;鄭服叢;王皓楠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 海南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12P21/00;A01N63/02;A01P3/00;C12R1/07
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司44218
• 代理人: 楊建新

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種缺失sfp基因的生防菌及其發(fā)酵工藝和應(yīng)用。

背景技術(shù)

芽孢桿菌是一類產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌株，它的分布廣泛，生理特征豐富，易于分離和培養(yǎng)，是自然界中重要的微生物菌群，芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，包括由非核糖體途徑合成的非核糖體肽類抗生素以及由核糖體途徑合成的細(xì)菌素、酶類及其他活性蛋白類抗菌物質(zhì)等。

168菌株是芽孢桿菌的模式菌株，也是目前研究的最為透徹的菌株，他的全基因組已于1997年測(cè)序完成。與野生芽孢桿菌不同的是模式菌株168由于在實(shí)驗(yàn)室的長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)，發(fā)生了很多的自發(fā)突變因而喪失了很多野生型的特點(diǎn)，比如sfp基因的自發(fā)突變，使得168菌株喪失了產(chǎn)生脂肽類化合物的能力，因而缺失了抑菌的能力。sfp基因編碼的4’-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶，是芽孢桿菌非核糖體途徑合成脂肽類化合物的關(guān)鍵基因。

本研究的目標(biāo)菌株HAB-2經(jīng)過(guò)一系列的前期實(shí)驗(yàn)表明：該菌株沒(méi)有sfp基因，但是通過(guò)現(xiàn)代的儀器分析手段我們又在HAB-2發(fā)酵液中檢測(cè)得到了由于sfp缺失而不可能得到的脂肽類物質(zhì)——表面活性素類物質(zhì)，這就說(shuō)明本研究的生防菌HAB-2具有特殊的代謝脂肽類的代謝途徑，值得進(jìn)一步的深入研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生防菌，其缺失sfp基因，但是具有產(chǎn)生脂肽類化合物的能力，具有極高的研究?jī)r(jià)值。本發(fā)明的另一目的是提供該生防菌的發(fā)酵工藝。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該生防菌的發(fā)酵物活性成分的提取方法，本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供該生防菌的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種缺失sfp基因的生防菌，為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)HAB-2，保藏編號(hào)為：CCTCC M 2015070。

本發(fā)明第二個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌的發(fā)酵工藝，將本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌接種于液體的溶菌肉湯培養(yǎng)基中，在26～30℃的條件下，50～500轉(zhuǎn)/分鐘搖菌1～3天，即得到發(fā)酵液。

優(yōu)選地，還包括前處理步驟：先將本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌接種于溶菌肉湯培養(yǎng)基上26～30℃下活化培養(yǎng)1～6天。

本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌的發(fā)酵物活性成分的提取方法，包括以下步驟：

步驟1，采用本發(fā)明第二個(gè)方面所述的發(fā)酵工藝制得發(fā)酵液，然后離心除去菌體，得到無(wú)菌發(fā)酵液；

步驟2，無(wú)菌發(fā)酵液用正丁醇萃取，取萃取液，濃縮除去正丁醇，即得。

本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供另一種本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌的發(fā)酵物活性成分的提取方法，包括以下步驟：

包括以下步驟：

a，采用本發(fā)明第二個(gè)方面所述的發(fā)酵工藝制得發(fā)酵液，然后離心除去菌體，得到無(wú)菌發(fā)酵液；

b，無(wú)菌發(fā)酵液用鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.5～3，1～10℃下靜置至少3h；

c，離心，棄去上清液，取沉淀，即得。

本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供又一種本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌的發(fā)酵物活性成分的提取方法，包括以下步驟：1)采用權(quán)利要求2～3任意一項(xiàng)所述的發(fā)酵工藝制得發(fā)酵液，然后離心除去菌體，得到無(wú)菌發(fā)酵液；

2)緩慢加入飽和硫酸銨，沉淀蛋白，1～10℃下靜置至少3h；

3)離心得到沉淀，待沉淀干燥后用1/5～1/20原發(fā)酵液體積的、pH值為6～8的Tris-HCl溶解沉淀，即得。

本發(fā)明的第六個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌在制備脂肽類抑菌制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第七個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的生防菌在制備防治植物真菌病害制劑中的應(yīng)用。

其中，所述植物真菌病害為番茄早疫病、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病、棉花枯萎病、橡膠炭疽病、橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病、茶輪斑病、芒果炭疽病、和或橡膠褐根病中的一種或多種。

本發(fā)明提供的菌株，經(jīng)多項(xiàng)分類鑒定，確定為解淀粉芽孢桿菌的一個(gè)新種，暫命名為解淀粉芽孢桿菌HAB-2(Bacillus amyloliquefaciens.HAB-2)，已于2015年1月27日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)進(jìn)行了菌種保藏，并證明存活，其保藏登記號(hào)為：CCTCC M 2015070，地址為武漢大學(xué)內(nèi)。