[發明專利]立體化培養細胞在骨科藥物篩選中的應用

在審

• 申請號: 201510059901.2
• 申請日: 2015-02-04
• 公開（公告）號: CN104774903A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 周光前
• 申請（專利權）人: 周光前
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.本發明提供立體化培養細胞在骨科藥物篩選中的應用，其具體步驟包括：

(1)轉瓶培養獲得大量細胞：采用干細胞常規培養方法獲得含大量人骨髓間充質干細胞的培養液，經800～1000rpm低速離心5-10min得人骨髓間充質干細胞；

(2)立體基質配制和交聯：取步驟(1)所獲得的人骨髓間充質干細胞10mL放入300mL培養瓶中，再加入100mL的1.2％巰基化透明質酸水溶液，攪拌5-10min后再加入50mL的15％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，進行均勻混合后立即倒入6孔板中，28-32℃靜置12-20min，得含有人骨髓間充質干細胞的立體化培養介質；

(3)與藥物立體化共培養：向6孔板中加入含不同濃度藥物的細胞培養液，在37℃的CO₂培養箱中培養；

(4)鏡檢觀察細胞狀態：與不同濃度的藥物培養時，每隔2h后直接將培養的6孔板放入倒置顯微鏡中觀察，確定各種藥物在不同濃度下細胞生長狀態；

(5)篩選藥物體系建立：根據顯微鏡觀察的細胞生長狀態確定各種藥物的濃度，取200mL的1.2％巰基化透明質酸水溶液放入500mL培養瓶中，加入步驟(1)所獲得的干細胞10mL，攪拌混合5-10min，100mL的15％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，進行均勻混合后立即倒入96孔板中，30℃靜置15min，向96孔板中加入各種藥物在37℃的CO₂培養箱中培養，每隔2h后直接將培養的96孔板放入倒置顯微鏡中觀察，快速篩選各種藥物的有效性和毒性。

2.根據權利要求1的方法，所述15％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液和1.2％巰基化透明質酸水溶液，是指質量體積比，用15g高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯用100mLPBS溶液溶解得15％高分子量聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，將2.4g巰基化透明質酸用200mLPBS溶液溶解得1.2％巰基化透明質酸水溶液，上述各種溶液是經過膜過濾除菌獲得無菌溶液。

3.根據權利要求1的方法，所述PBS溶液是指氯化鈉NaCl?0.4g、磷酸二氫鉀KH₂PO₄?0.024g、磷酸氫二鈉Na₂HPO₄?0.164g、氯化鉀KCl?0.01g、碳酸氫鈉NaHCO₃?0.3g用水配成100mL。

4.根據權利要求1的方法，所述藥物是指小分子有機物、抗生素、多肽蛋白類藥物等水溶性或脂溶性藥物。