[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)抗豬流行性腹瀉病毒抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒及其使用方法和用途

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510059767.6
• 申請(qǐng)日: 2015-02-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104730238A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃小波;曹三杰;張雨迪;文心田;段素芬;文翼平;伍銳;朱書(shū)權(quán);鄧麗;李亞青
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/569
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/569;G01N33/561
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)抗豬流行性腹瀉病毒抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒及其使用方法和用途。

背景技術(shù)

豬流行性腹瀉(Porcine?epidemic?diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine?epidemic?diarrhea?virus,PEDV)引起的一種以嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征的急性高度接觸性腸道傳染病，哺乳仔豬感染后具有高致死率和高感染率。各個(gè)年齡段的豬均易感染，該病最初于1971年在比利時(shí)和英國(guó)發(fā)現(xiàn)，此后，許多國(guó)家陸續(xù)報(bào)道該病的流行，在仔豬尤為嚴(yán)重，1976年我國(guó)首次報(bào)道該病；1955年，國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(International?Committeeon?Taxonomy?of?Viruses,ICTV)在第6次報(bào)告中將豬流行性腹瀉病毒歸為冠狀病毒屬。盡管我國(guó)部分豬場(chǎng)采取了PEDV的疫苗免疫措施，但我國(guó)自2010年以來(lái)，全國(guó)大部分養(yǎng)豬地區(qū)再度暴發(fā)該病，造成極其嚴(yán)重的損失。近年，韓國(guó)也發(fā)生該病流行，至2013年以來(lái)該病又在美國(guó)、日本等國(guó)家也相繼發(fā)生，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。總體上，該病已遍布世界養(yǎng)豬地區(qū)，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，對(duì)PEDV的診斷方法主要有臨床診斷、免疫膠體金、ELISA、RT-PCR等診斷方法。他們的準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性都很好逐漸被人們所重視。ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，它是目前應(yīng)用比較多，發(fā)展比較快的一種抗體檢測(cè)方法。此方法即可檢測(cè)抗原，能夠直接檢測(cè)出糞便中的抗原，也可以檢測(cè)抗體，當(dāng)豬場(chǎng)當(dāng)中出現(xiàn)腹瀉的癥狀時(shí)即可用于檢測(cè)，可做到早診斷，早治療，被廣泛的應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

現(xiàn)有文獻(xiàn)中制備的檢測(cè)試劑盒，準(zhǔn)確度不高，市售的試劑盒的準(zhǔn)確度較高，如，R&B公司的Porcine-PEDV試劑盒，但是售價(jià)高，使用成本高。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)PEDV。

本發(fā)明檢測(cè)抗豬流行性腹瀉病毒抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒，它是以氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的重組豬流行性腹瀉病毒N蛋白為抗原，檢測(cè)待檢樣品中是否含有抗豬流行性腹瀉病毒的抗體。

所述ELISA檢測(cè)試劑盒為間接ELISA檢測(cè)試劑盒，它包括如下組分：

(1)氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的重組豬流行性腹瀉病毒N蛋白；

(2)酶標(biāo)板；

(3)抗原包被液；

(4)洗滌液；

(5)封閉液；

(6)樣品稀釋液；

(7)酶標(biāo)二抗；

(8)底物液；

(9)終止液。

其中，所述抗原包被液是為碳酸鹽溶液。

其中，所述洗滌液是PBST溶液。

PBST溶液：pH7.4，0.2g?KH2PO4，0.2g?KCl，2.9g?Na2HPO4.12H2O，8.0g?NaCl，0.5mL?Tween-20，加入去離子水定容至1000mL。

其中，所述封閉液為5％的脫脂牛奶、1％的BSA或3％的明膠。

其中，所述樣品稀釋液為PBST溶液。

其中，所述酶標(biāo)二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗豬IgG。

其中，所述底物液是濃度為0.208mmol/L的TMB溶液。

其中，所述終止液是濃度為2mol/L的H₂SO₄溶液。

本發(fā)明還提供了前述檢測(cè)試劑盒的使用方法，它包括如下步驟：

(1)包被：取氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的重組豬流行性腹瀉病毒N蛋白，用包被液稀釋至蛋白濃度為0.313～10μg/mL，包被酶標(biāo)板，洗滌；

(2)封閉：加入封閉液封閉，洗滌；

(3)加待檢樣品：取待檢樣品，用稀釋液稀釋10～320倍，加入微孔板中，37℃溫育1h，洗滌；

(4)加酶標(biāo)二抗：取酶標(biāo)二抗，用稀釋液稀釋2000倍，加入微孔板中，37℃反應(yīng)30min，洗滌；

(5)加底物：加入底物液，室溫避光反應(yīng)10～15min；

(6)終止反應(yīng)：加入終止液，終止反應(yīng)，測(cè)定其OD450值。

步驟(1)中，所述用包被液稀釋至蛋白濃度為2.5μg/mL。

步驟(2)中，待檢樣品，用稀釋液稀釋20倍。

本發(fā)明還提供了前述檢測(cè)試劑盒在制備豬流行性腹瀉病毒的檢測(cè)試劑盒中的用途。