[發明專利]用于檢測GDNF剪接變異體1、3的實時熒光定量PCR專用引物

在審

• 申請號: 201510059437.7
• 申請日: 2015-02-04
• 公開（公告）號: CN105039503A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 李亨;高殿帥;姚瑞琴;張寶樂;曲德偉;何濤;柴祥
• 申請（專利權）人: 徐州醫學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;呂鵬濤

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體涉及檢測GDNF剪接變異體的實時熒光定量PCR的引物，特別涉及一種檢測GDNF剪接變異體1(GenecodeNO.：NM_000514.3)和剪接變異體3(GenecodeNO.:NM_001190468.1)表達水平的引物。

背景技術

膠質細胞系源性神經營養因子(glialcell-linederivedneurotrophicfactor,GDNF)是一個研究歷史較長的蛋白，最初在大鼠膠質瘤細胞株B49的培養基中分離出來，被認為可維持神經元的發育和再生，促進神經元軸突的生長(Linetal.1993)。從蛋白質結構來看，GDNF屬轉化生長因子-β超家族成員(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)(AiraksinenandSaarma,2002)。距今為止，各國研究者對它的研究已接近20年，對其生物學作用也開展了多方面探索，認為該蛋白不僅僅以旁分泌途徑作用于其他細胞，也以自分泌途徑作用于自身，是一個具重要調節作用多效能營養因子。比如：在帕金森病動物模型和一些體外研究中，該因子保護多巴胺能神經元，是一個很重要的治療帕金森病的候選因子(Linetal.,1993；etal.,2000；AiraksinenandSaarma,2002)；在生殖方面的研究中，GDNF可在支持細胞中分泌，通過旁分泌途徑對精原干細胞的增值和分化起具有決定作用(Guanetal,2006)。

人類GDNF基因位于5號染色體p12-p13.1區，含2個啟動子、4個內含子和5個外顯子(BaeckerPAetal,1999，結構模式圖詳見圖1)。該基因在轉錄過程中外顯子4發生5’選擇性剪切，同時由于存在兩個啟動子，可轉錄為不同的mRNA序列，其剪接模式詳見圖2。

在對基因轉錄過程中的產生的各種mRNA剪接變異體進行檢測過程中，通常采用復雜且昂貴的雜交探針，相較于雜交探針的方法，采用熒光定量PCR具有快速、廉價和精確的特點，為達到檢測基因的選擇性剪接目的，適應于熒光定量方法，篩選出合適的引物以及適當的PCR擴增條件體系是關鍵。針對現有技術的檢測發現，國內外尚未用于檢測GDNF剪接變異體1、3(亦即pre-(α)pro-GDNF)的實時熒光定量PCR專用引物及方法的報道。

發明內容

為解決以上技術問題，需要開發專門用于檢測pre-(α)pro-GDNFmRNA表達水平的實時熒光定量PCR專用引物。

本發明目的之一在于提供一種特異性引物，用于人組織或細胞內剪接變異體1(GenecodeNO.：NM_000514.3)和剪接變異體3(GenecodeNO.:NM_001190468.1)熒光定量檢測(注：如背景技術所述，區別與剪接變異體GDNF剪接變異體2(GenecodeNO.：NM_001190469.1)和剪接變異體4(GenecodeNO.:NM_199231.2)，由于該兩個剪接變異體存在相同的78bp剪接片段，該種類型剪接變異體被稱之為pre-(α)pro-GDNF，故以下均用pre-(α)pro-GDNF代表以上cDNA序列)。

本發明的另一個目的在于提供一種用于檢測人組織或細胞內pre-(α)pro-GDNF實時熒光定量檢測的實時熒光定量PCR的方法。

本發明的目的是這樣實現的：

一種用于檢測pre-(α)pro-GDNFmRNA表達水平實時熒光定量的引物，其關鍵在于:其特異性雙向引物，其核苷酸序列分別如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。

特異性序列的引物序列為：

上游引物：CGCCGGACGGGACTTTAA(SEQIDNO.1)，

下游引物：CCGAGGGAGCGGTCTTCG(SEQIDNO.2)。

一種用于檢測人組織或細胞內檢測pre-(α)pro-GDNFmRNA表達水平的實時熒光定量方法。其特征包括以下幾個步驟：人組織或細胞cDNA標準品的制備，以樣品cDNA為模板，利用本發明提供的引物進行熒光定量PCR，建立實時熒光定量PCR的體系。

本發明提供的優選實時熒光定量擴增反應程序：

應用480SystemRealTimePCR擴增儀，95℃預變性30秒，1Cycle；95℃變性5秒，60℃退火20秒，72℃延伸10秒，40Cycles；