[發明專利]用于檢測GDNF剪接變異體1、3的實時熒光定量PCR專用引物

在審

• 申請號: 201510059437.7
• 申請日: 2015-02-04
• 公開（公告）號: CN105039503A
• 公開（公告）日: 2015-11-11
• 發明（設計）人: 李亨;高殿帥;姚瑞琴;張寶樂;曲德偉;何濤;柴祥
• 申請（專利權）人: 徐州醫學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;呂鵬濤

1.用于檢測GDNF剪接變異體1、3的實時熒光定量PCR專用引物，其特征在于其為特異性雙向引物，其上游引物為SEQIDNO.1，下游引物為SEQIDNO.2。

2.根據權利要求1所述的用于檢測GDNF剪接變異體1、3的實時熒光定量PCR專用引物，其特征在于所述引物用于檢測人組織或細胞內的pre-(α)pro-GDNF。

3.根據權利要求1或2所述的用于檢測GDNF剪接變異體1、3的實時熒光定量PCR專用引物，其特征在于所述引物用于檢測人組織或細胞內剪接變異體1(GenecodeNO.：NM_000514.3)和剪接變異體3(GenecodeNO.：NM_001190468.1)表達量。

4.一種應用權利要求1所述的PCR專用引物檢測GDNF剪接變異體1、3表達水平的實時熒光定量方法，其特征在于其包括如下步驟：人組織或細胞cDNA標準品的制備，以樣品cDNA為模板，利用本發明提供的引物進行熒光定量PCR，建立實時熒光定量PCR的體系。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于應用480SystemRealTimePCR擴增儀，其指標均按以下程序進行：95℃預變性30秒，1Cycle；95℃變性5秒，60℃退火20秒，72℃延伸10秒，40Cycles。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于將所有DNA樣品分別配置RealtimePCR反應體系；該體系配置如下：PremixExTaq(TAKARADRR041A)10μl，PCRForwardPrimer(SEQIDNO.1，10μM)0.5μl，PCRReversePrimer(SEQIDNO.2，10μM)0.5μl，cDNA模板1μl，dH₂O8μl。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于配置RealtimePCR反應體系后，輕彈管底將溶液混合，5000rpm短暫離心；將19μl混合液加到PCR板對應的每個孔中，再加入對應的1μlDNA，小心粘上封口膜，并短暫離心混合；在設置PCR程序前將準備好的PCR板放在冰上。

8.一種用于檢測GDNF剪接變異體1、3表達水平的實時熒光定量方法的PCR試劑盒，其特征在于其包含權利要求1所述的上游引物SEQIDNO.1和下游引物SEQIDNO.2。

9.權利要求1所述的PCR專用引物在實時熒光定量檢測GDNF剪接變異體1、3表達水平方面的應用。