[發(fā)明專利]一種過表達(dá)c2orf68基因質(zhì)粒構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510052681.0
• 申請日: 2015-02-02
• 公開（公告）號: CN104726493A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳堯;蔣婷婷
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/12;C12Q1/68
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種能過表達(dá)c2orf68基因表達(dá)的真核重組質(zhì)粒，以及利用該重組過表達(dá)質(zhì)粒研究c2orf68功能提供了良好工具，也為研究人肝癌、人結(jié)直腸癌及其它惡性腫瘤中c2orf68基因的功能提供有效實(shí)驗(yàn)方法。

背景技術(shù)

肝細(xì)胞癌（hepatoceLLuLar?carcinoma,HCC），簡稱人肝癌，?在世界范圍內(nèi)是第五位最常見的癌癥，也是死亡率最高的癌癥之一。在我國每年因人肝癌死亡的人數(shù)超過30萬，僅次于肺癌，位居我國惡性腫瘤死亡率的第二位。結(jié)直腸腺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，近年來，其發(fā)病率逐年攀升，占所有惡性腫瘤的第二位。在歐洲，結(jié)直腸腺癌占惡性腫瘤相關(guān)致死病因的第二位。在中國的一些大城市，結(jié)直腸癌的發(fā)病率也達(dá)到所有惡性腫瘤發(fā)病率的2到5位。由于大多數(shù)惡性腫瘤具有特殊的生物學(xué)特性，早期診斷困難，易于發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)，所以遠(yuǎn)期治療效果不佳。惡性腫瘤的早期發(fā)生的分子機(jī)制尚未完全闡明，因此深入了解癌癥發(fā)生的分子機(jī)理，對于研究開發(fā)癌癥早期診斷治療有重要作用。

基因工程，又稱為基因重組技術(shù)，是二十世紀(jì)七十年代發(fā)展起來的在體外對DNA進(jìn)行操作的一門技術(shù)，廣泛用于疾病基礎(chǔ)研究、基因治療、基因免疫、基因疫苗等。其三要素分別為：酶、目的基因、載體。而真核表達(dá)載體是基因工程中用于構(gòu)建真核基因表達(dá)系統(tǒng)的一種載體，近幾十年來，各國學(xué)者圍繞真核表達(dá)載體進(jìn)行了各種疾病、基因等相關(guān)研究，在基因工程方面做了大量工作，為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究開辟了嶄新途徑。c2orf68?基因編碼的蛋白C2ORF68?中，含一個126?個氨基酸的UPF0561?結(jié)構(gòu)域，屬于UPF0561?蛋白家族。迄今為止，尚無任何關(guān)于UPF0561蛋白家族的功能報(bào)道。

因此，本發(fā)明運(yùn)用基因重組技術(shù)，針對c2orf68基因，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-c2orf68，并將其轉(zhuǎn)染低表達(dá)或不表達(dá)c2orf68的肝癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染c2orf68基因的細(xì)胞株，為研究c2orf68功能提供了良好工具，亦為進(jìn)一步研究c2orf68基因在肝癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)，同時也為研究人肝癌、人結(jié)直腸癌及其它惡性腫瘤中c2orf68基因的功能提供有效實(shí)驗(yàn)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新型的真核重組質(zhì)粒及其制備方法，并證明所述重組質(zhì)粒為c2orf68功能研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)工具，也為研究人肝癌、人結(jié)直腸癌等及其它惡性腫瘤中c2orf68基因的功能提供有效實(shí)驗(yàn)方法。

人c2orf68基因已在GenBank注冊，注冊號NM_001013649.3，定位于2p11.2，全長4283bp，編碼166個氨基酸，其核苷酸序列為序列表中SEQ?ID?NO：1所述。人c2orf68基因的組織表達(dá)譜分析顯示：該基因在人結(jié)直腸癌等胃腸腫瘤中均有表達(dá)。本發(fā)明所述的真核重組質(zhì)粒，由序列表SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列中的CY-?c2orf68片段與真核載體構(gòu)建而成，所述CY-?c2orf68片段是起始密碼子下游73bp~573bp的核苷酸序列。

本發(fā)明所述的真核重組質(zhì)粒，其制備方法依次包括以下的步驟：

（1）通過半巢式PCR合成人的CY-?c2orf68基因片段；

（2）將上述獲得的核苷酸片段與真核質(zhì)粒連接，該插入片段的酶切位點(diǎn)分別為XhoⅠ和EcoRⅠ，再將所述真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出正確插入的真核重組質(zhì)粒的克隆；

（3）使用堿裂解法抽提真核重組質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析所建的真核重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析。

（4）將上述獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SMMC7721人肝癌細(xì)胞、及LoVo人結(jié)直腸癌細(xì)胞，觀察細(xì)胞生物學(xué)特性。

（5）?實(shí)驗(yàn)表明，將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人肝癌及人結(jié)直腸癌細(xì)胞，重組質(zhì)粒作用于人c2orf68基因可導(dǎo)致結(jié)人肝癌細(xì)胞的增殖，因此，本發(fā)明有助于研究c2orf68基因功能，并且為研究c2orf68基因在人肝癌及人結(jié)直腸癌中發(fā)病的作用提供了有用分子生物學(xué)工具?。

附圖說明

圖1為本發(fā)明真核重組載體pcDNA3.1(+)的結(jié)構(gòu)示意圖。