[發明專利]一種過表達c2orf68基因質粒構建方法及其應用

在審

• 申請號: 201510052681.0
• 申請日: 2015-02-02
• 公開（公告）號: CN104726493A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發明（設計）人: 陳堯;蔣婷婷
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/12;C12Q1/68
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種真核重組表達質粒，其特征在于：其c2orf68基因CY-?c2orf68片段與真核表達質粒重組構建。

2.其目的序列的脫氧核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，位于c2orf68基因第73~573位。

3.根據權利要求1所述的真核表達質粒，其特征在于其真核表達載體為以下其中的一種：pcDNA3.1（+）、pcDNA3.1（-）、GPU6、pGPU6/GFP/Neo、Pgpu6/Hygro、Pgph1/GFP/Neo、CMV-RFP-MCS(MIR30)-SV40-Neomycin、CMV-EGFP-MCS(MIR30)-SV40-Neomycin。

4.一種真核重組質粒的制備方法，其特征在制備過程的如下：

（1）通過半巢式PCR合成人的CY-?c2orf68基因片段；

（2）將上述獲得的核苷酸片段與真核質粒連接，該插入片段的酶切位點分別為XhoⅠ和EcoRⅠ，再將所述真核重組質粒轉化到感受態細菌細胞中進行培養，然后篩選出正確插入的真核重組質粒的克隆；

（3）使用堿裂解法抽提真核重組質粒，利用限制性內切酶酶切圖譜分析所建的真核重組質粒，并進行DNA序列分析。

5.根據權利要求1所述的重組質粒，構建穩定人肝癌細胞株和穩定人結直腸癌細胞株后，其特征在于在人肝癌SMMC7721^+CY-c2orf68細胞中，c2orf68基因表達水平實驗組比空白對照組上升45.4%（P<0.001），實驗組比陰性對照組上升46.4%（P<0.001），過表達c2orf68基因能夠明顯促進人肝癌細胞SMMC7721的增殖，抑制細胞凋亡。

6.LoVo細胞轉染后，特征在于在人結直腸癌LoVo^+CY-c2orf68細胞中實驗組、陰性對照組及空白對照組的c2orf68基因相對表達水平分別為2.58、0.892和0.849（P<0.005）。

7.一種如權利要求1所述的重組質粒，可用于研究人肝癌及人結直腸癌及其它惡性腫瘤c2orf68基因功能。