[發(fā)明專利]一種過表達(dá)c2orf68基因質(zhì)粒構(gòu)建方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510052681.0
• 申請(qǐng)日: 2015-02-02
• 公開（公告）號(hào): CN104726493A
• 公開（公告）日: 2015-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳堯;蔣婷婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/66;C12N15/12;C12Q1/68
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種真核重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于：其c2orf68基因CY-?c2orf68片段與真核表達(dá)質(zhì)粒重組構(gòu)建。

2.其目的序列的脫氧核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，位于c2orf68基因第73~573位。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于其真核表達(dá)載體為以下其中的一種：pcDNA3.1（+）、pcDNA3.1（-）、GPU6、pGPU6/GFP/Neo、Pgpu6/Hygro、Pgph1/GFP/Neo、CMV-RFP-MCS(MIR30)-SV40-Neomycin、CMV-EGFP-MCS(MIR30)-SV40-Neomycin。

4.一種真核重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在制備過程的如下：

（1）通過半巢式PCR合成人的CY-?c2orf68基因片段；

（2）將上述獲得的核苷酸片段與真核質(zhì)粒連接，該插入片段的酶切位點(diǎn)分別為XhoⅠ和EcoRⅠ，再將所述真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，然后篩選出正確插入的真核重組質(zhì)粒的克隆；

（3）使用堿裂解法抽提真核重組質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析所建的真核重組質(zhì)粒，并進(jìn)行DNA序列分析。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，構(gòu)建穩(wěn)定人肝癌細(xì)胞株和穩(wěn)定人結(jié)直腸癌細(xì)胞株后，其特征在于在人肝癌SMMC7721^+CY-c2orf68細(xì)胞中，c2orf68基因表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組比空白對(duì)照組上升45.4%（P<0.001），實(shí)驗(yàn)組比陰性對(duì)照組上升46.4%（P<0.001），過表達(dá)c2orf68基因能夠明顯促進(jìn)人肝癌細(xì)胞SMMC7721的增殖，抑制細(xì)胞凋亡。

6.LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，特征在于在人結(jié)直腸癌LoVo^+CY-c2orf68細(xì)胞中實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組的c2orf68基因相對(duì)表達(dá)水平分別為2.58、0.892和0.849（P<0.005）。

7.一種如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，可用于研究人肝癌及人結(jié)直腸癌及其它惡性腫瘤c2orf68基因功能。