[發明專利]一種豬流行性腹瀉病毒的培養方法

有效

• 申請號: 201510052418.1
• 申請日: 2015-01-31
• 公開（公告）號: CN104611297B
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 馮曉聲;賈愛卿;王貴平
• 申請（專利權）人: 廣東海大畜牧獸醫研究院有限公司;四川海林格生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙)44288
• 代理人: 羅偉添

技術領域

本發明涉及微生物病毒領域，更具體地說，涉及一種豬流行性腹瀉病毒的培養方法。

背景技術

豬流行性腹瀉病毒嚴重影響了我國的養豬業，其感染性強、危害性大，是影響全球養豬業的最重要病毒之一，哺乳仔豬感染后死亡率可達100％，母豬常以帶毒而不表現癥狀形式出現。豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬的1群，傳染性胃腸炎，貓冠狀病毒、犬冠狀病毒與其屬于同一冠狀病毒屬(Utiger等，1995a)。豬流行性腹瀉病毒最初在20世紀70年代被發現，首次發現的病毒經分離純化及傳代后的病毒被命名為CV777，至今很多疫苗生產單位仍然在使用該毒株作為疫苗毒株使用。最近幾年在臨床上爆發了嚴重的哺乳仔豬腹瀉，且死亡率極高，因此各研究機構都在對引起該疾病的病原進行分析。調查結果顯示，引起哺乳仔豬腹瀉并死亡的主要病原為豬流行性腹瀉病毒，通過對現流行毒株的基因分析，發現流行毒株與二十世紀70年代分離到的CV777毒力基因發生了較大的改變，所以這也許是用含有原始毒株的疫苗免疫失敗的原因之一。

目前，各個研究機構對臨床分離的豬流行性腹瀉病毒進行了體外細胞感染，試圖通過體外培養來使該病毒增殖以期用于目前的豬流行性腹瀉的防控。國內外有多篇文獻報道指出，臨床分離到的豬流行性腹瀉病毒可以用多種細胞進行體外感染，如VERO細胞、BHK細胞等，但臨床新分離的豬流行性腹瀉病毒野毒株很難培養，并且培養后基本測不到半數組織細胞感染量(TCID50)，這給該病毒擴大生產及病毒量確定造成了巨大難題，所以如何提高病毒對細胞的浸染效率使之適應體外規模化培養是該病毒體外培養的難點所在。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于，針對現有技術的上述缺陷，提供一種豬流行性腹瀉病毒的培養方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：本發明提供一種豬流行性腹瀉病毒的培養方法，包括以下步驟：

(1)DMEM培養基的配制：將13.4克DMEM干粉溶于一升的去離子水中，攪拌至完全溶解后，調節pH值至6.8-7.8，并用≤0.22μm的無菌濾膜進行除菌過濾，置于≤4℃的冰箱待用；

(2)在上述配制好的DMEM培養基中加入占DMEM培養基體積1-8％的胎牛血清，并將該DMEM培養基置于培養容器內進行單層細胞的培養；

(3)將形成有單層細胞的培養容器內的DMEM培養基棄去，并用洗液洗滌2-3次；

(4)棄去洗液，向形成有單層細胞的培養容器內加入豬胰蛋白酶、細胞親和劑和步驟(1)中的DMEM培養基，其中豬胰蛋白酶的用量為DMEM培養基體積用量的0.1-0.5％，細胞親和劑用量為DMEM培養基體積用量的0.01-1％；

(5)將步驟(4)中加入豬胰蛋白酶和細胞親和劑的DMEM培養基放置細胞培養箱中靜置培養1分鐘-30分鐘，靜置培養后取出并迅速接種豬流行性腹瀉病毒，混合均勻后放置于細胞培養箱進行培養，收集豬流行性腹瀉病毒液。

本發明所述的豬流行性腹瀉病毒的培養方法，其中，步驟(2)中所述的單層細胞為Vero單層細胞、293單層細胞、ST單層細胞、BHK單層細胞中的任意一種。

本發明所述的豬流行性腹瀉病毒的培養方法，其中，步驟(3)中所述的洗液為無菌去離子水、無菌PBS、無菌無血清DMEM培養液中的任意一種。

本發明所述的豬流行性腹瀉病毒的培養方法，其中，在步驟(4)中所述的細胞親和劑由原料混合液制成，所述原料混合液由按照質量百分數計的如下組分：

本發明所述的豬流行性腹瀉病毒的培養方法，其中，在步驟(4)中所述的細胞親和劑由原料混合液制成，所述原料混合液由按照質量百分數計的如下組分：

本發明所述的豬流行性腹瀉病毒的培養方法，其中，所述無機鹽由氯化鈉、氯化鉀和磷酸二氫鈉組成，所述氯化鈉占細胞親和劑總重的0.1-1.2％；所述氯化鉀占細胞親和劑總重的0.1-1％；所述磷酸二氫鈉占細胞親和劑總重的0.16-0.8％。

本發明所述的豬流行性腹瀉病毒的培養方法，其中，所述氯化鈉占細胞親和劑總重的0.2-0.8％；所述氯化鉀占細胞親和劑總重的0.3-0.5％；所述磷酸二氫鈉占細胞親和劑總重的0.25-0.5％。

本發明所述的豬流行性腹瀉病毒的培養方法，其中，所述細胞親和劑的制備方法如下，按照質量百分比稱取適量的蘋果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉和去離子水，將上述各組分溶于去離子水中，過濾即得。